提高cAMP水平减少卵母细胞非整倍体形成的作用机制

卵母细胞体外成熟(IVM)增加减数分裂异常发生，导致卵母细胞及受精后的胚胎非整倍体发生显著增加。前期研究发现应用核成熟抑制剂Cilostamide和Forskolin后，成熟率及其后胚胎发育结局明显改善，卵母细胞p34cdc2，Bub1表达显著增加，体外成熟卵母细胞的非整倍体率明显降低。本研究将使用人和小鼠卵母细胞，采用CGH染色体检测、卵母细胞胞浆显微注射等方法进一步深入探讨Cilostamide和Forskolinp是促进卵母细胞p34cdc2，Bub1表达显著增加的作用途径和机制；阐明p34cdc2和Bub1在减数分裂的作用，为p34cdc2，Bub1作为作用靶点，改进体外成熟卵母细胞结局提供科学依据；探讨抑制卵丘颗粒细胞生成MAS是否可延长cAMP类可逆性核成熟抑制剂对核成熟的抑制时间对卵母细胞体外成熟的影响，为改善人类卵母细胞体外成熟的效果开辟一条新的思路和方法。

课题发现环磷酸腺苷合成酶激活Forskolin及卵浆内磷酸酯酶的抑制剂 Cilostamide两者协同作用能够有效地抑制大鼠卵母细胞核成熟,且对卵母细胞的抑制作用是可逆的,为卵母细胞的胞浆和核的同步成熟赢得了时间,使卵母细胞在最后生长阶段积累足够的蛋白质和mRNA，其中减数分裂调控密切相关蛋白p34cdc2，Bub1的表达明显增强。我们研究发现体外成熟卵母细胞纺锤体形态、染色体和动力分布异常现象增加，采用cAMP类可逆性核成熟抑制剂进行成熟前培养可减少体外成熟卵母细胞纺锤体形态、染色体和动力分布异常现象。证实了Bub1在成熟前的生成和积累对其后的正常减数分裂起了关键作用，采用环磷酸腺苷合成酶激活Forskolin及卵浆内磷酸酯酶的抑制剂Cilostamide抑制核成熟，延长体外成熟前培养时间是一种有效改善结局的方法。 实验还证实了线粒体数量少、功能和动态分布的异常改变可能是体外成熟卵母细胞体外成熟率低和染色体非整倍体发生率高的假设。以上实验提示卵母细胞内在的质量是其发育到优质胚胎的决定性因素，对卵母细胞中线粒体增殖、功能和动态分布的探讨有助于对体外成熟卵母细胞成熟、受精和胚胎发育异常的了解。线粒体通过氧化磷酸化合成ATP，是有核细胞能量的主要来源。足量的ATP是卵母细胞完成第一次减少分裂的关键因素。线粒体还是卵母细胞内钙离子活动的调节和储存器，在卵母细胞发育和成熟过程中，线粒体动态分布于微管等周围提供ATP和钙离子，促进胞内细胞器和骨架重组完成。卵胞浆内的线粒体对卵母细胞成熟、受精及以后胚胎的发育起着重要的作用。针对Ca2+作为细胞内的信使物质，在细胞转换期出现释放峰，其浓度波动与细胞周期变化密切相关。研究证实Ca2+在卵母细胞减数分裂成熟的过程中发挥了重要的作用,抑制Ca2+活动导致染色体分裂异常。课题组创新性地发现在卵母细胞体内和体外成熟中前期的卵子和卵丘颗粒细胞的cAMP峰起了关键作用，而成熟中后期卵子和卵丘颗粒细胞的高cAMP水平并不能促进卵子成熟，相反导致卵子发育能力降低。在卵母细胞体内和体外成熟中前期的卵子和卵丘颗粒细胞的cAMP峰起了关键作用，促进卵母细胞内Ca2+储备，GVBD前的Ca2+震荡峰增加，促进了MII期卵母细胞纺锤体的正常形成和染色体分离。Ca2+作用的一个部位可能是钙调素，使用钙调素的抑制剂能抑制GVBD的发生。