线粒体外膜电压依赖阴离子通道VDAC差异表达在母系遗传性高血压发病中的调控机制研究

Essential hypertension （EHT）is an independent risk factor for stroke, coronary heart disease and end-stage renal failure and other diseases. EHT is influenced by multiple factors such as environmental factors and genetic factors. Recently, some studies have shown that maternally inherited hypertension was associated with mitochondrial DNA (mtDNA) mutations, but the mechanism is still unclear. In this study, EHT patients associated with mtDNA were identified and verified by mitochondrial function evaluation. The vascular smooth muscle cells and endothelial progenitor cells (EPC) were isolated and induced to endothelial cells. Differential expression of voltage-dependent anion channel (VDAC) located at mitochondrial outer membrane were studied with RT-PCR and two-dimensional gel electrophoresis. To observe the change of [Ca2+]m, [Ca2+]c and mitochondrial membrane potential with influenced by VDAC selective blockers and ROS intervention. The fluorescence resonance energy transfer (FRET) technique was used to observe the dynamic interaction between VDAC and endometrial calcium channel MCU. The pathogenesis mechanism of mtDNA mutations in maternally inherited hypertension is initially discussed, which provide a theory for early diagnosis and genes intervention of maternally inherited hypertension.

原发性高血压（EHT）是导致脑卒中、冠心病和晚期肾功能衰竭等疾病的独立危险因素。EHT受环境因素和遗传因素等多因素影响，近来研究表明母系遗传性高血压与线粒体基因（mtDNA）突变有关，但其具体作用机制尚未有系统研究报道。本课题通过高血压风险评估模型和线粒体功能验证筛查和发现mtDNA突变相关的高血压患者，分离血管平滑肌细胞和外周血内皮祖细胞，分别构建血管平滑肌细胞系和诱导分化内皮细胞系，以线粒体外膜电压依赖阴离子通道（Voltage-dependent anion channel, VDAC）为研究靶点，利用RT-PCR测序和双向凝胶电泳对比研究不同细胞系VDAC基因和蛋白表达差异，并利用VDAC选择性阻断剂和ROS干预下，观察对线粒体基质内钙、细胞内钙以及线粒体膜电势的影响，并利用荧光共振能量转移（FRET）技术观察VDAC与线粒体内膜钙离子通道MCU之间动态相互作用，初步探讨mtDNA突变在高血压发病中的作用机制，为具有母系遗传的原发性高血压早期诊断提供理论依据。

前期研究发现线粒体基因（mtDNA）在高血压发病过程中发挥重要作用，但mtDNA突变如何导致线粒体内稳态改变进而促进血压升高，目前机制尚不清楚。本研究以线粒体外膜电压依赖阴离子通道（VDAC）为研究靶点，系统研究携带mtDNA突变的不同组织及细胞表达，以及对线粒体功能的影响作用及机制。本研究以线粒体外膜电压依赖阴离子通道（VDAC）为研究靶点，系统研究携带mtDNA突变的不同组织及细胞表达，以及对线粒体功能的影响作用及机制。首先研究通过构建遗传模式识别模型，线粒体对收缩压影响作用占9.3%，对舒张压影响占4.9%。对140例高血压患者和124例非高血压22个tRNA片段进行测序分析，结果发现22个tRNA突变，其中包括9个新发现的突变和13个已报道的tRNA。进一步证实了线粒体基因组对血压的影响。研究携带tRNAMet C4467A突变的母系遗传高血压家系，发现突变的永生淋巴细胞较对照细胞VDAC和凋亡相关蛋白Bax和AIF表达明显增高，VDAC和Bax结合增加，AIF从线粒体释放进入细胞浆内。突变细胞ROS合成增加，而OCR降低，线粒体内稳态改变。携带突变的内皮祖细胞和平滑肌细胞VDAC和Bax表达增高。VDAC在携带tRNAIleA4263G的母系遗传性高血压患者中表达增高，MCU表达降低，两者之间无直接结合；突变细胞（[Ca2+]c）增高，而线粒体内钙（[Ca2+]m）降低。携带tRNA突变的自发性高血压大鼠（SHR）心肌肥厚改变明显，心肌细胞VDAC和Bax蛋白表达增加，两者结合增加，ROS合成增加。携带突变SHR肾损害明显，VDAC和Bax表达及结合明显增高。肾小球上皮细胞加入VDAC激动剂（Atr）后ROS增加，线粒体膜电势降低，而加入VDAC拮抗剂（CsA）后ROS降低，线粒体膜电势增加。研究进一步证实母系遗传（既线粒体基因）对血压影响作用，构建母系遗传高血压风险评估模型，为高危高血压患者早期筛查、早期干预治疗提供理论依据。从细胞和动物水平证实VDAC在携带线粒体tRNA突变的高血压发病过程中表达改变，导致了线粒体内稳态改变，参与线粒体功能的调控。