奥克梯隆型皂苷生物合成关键酶UGT基因克隆与功能分析

Panax vienamensis var. fuscidiscus particularly and highly accumulates ocotillol-type Majonoside R2（MR2）, but its biosynthesis and regulation mechanism is still unclear, especially on the key reaction of glycosylation, which is catalyzed by UGT-glycosyltransferase（UGT）.we compared the structural and biosynthetic pathways of triterpenoid saponins, such as ginsenoside Rb1, Rh2, Rg3, Compound K, F2, Fd, Rh1, F1, Rg1, Pseudo-Ginsenoside RT4, MR2 and so on in our preliminary study, and speculated that the last step of MR2 biosynthesis was the glycosylation reaction is catalyzed by its specific UGT (PvfUGT1 and PvfUGT2). To elucidate the biosynthesis pathway of MR2 in P. vienamensis var. fuscidiscus, Based on the transcriptome data of the existing P. vienamensis var. fuscidiscus and subsequent comparative transcriptome analysis, the UGT gene of P. vienamensis var. fuscidiscus was obtained. The catalytic characteristics of the enzyme and the function of UGT gene will be detected by heterologous expression in bacterialand yeast expression system. Furthermore, the temporal and spatial expression of PE gene and the effects of environment factors on their expression will be detected by Real-time PCR. The results of this study will provide a full understanding of biosynthesis of ocotillol-type ginsenoside, and explore the expression patterns of UGT and the effects of environmental factors. In order to analyze the complete biosynthetic pathway of MR2 by this foundation, provide theoretical basis for the cultivation of high octillol- type saponin ginseng plant by molecular breeding technology, and lay the foundation for the production of MR2 by synthetic biology method.

奥克梯隆型皂苷MR2是越南人参变种（俗称野三七）的主要活性成分，但其生物合成途径还不明确，尤其是催化最后一步糖基化反应的关键酶糖基转移酶（UGT）研究，尚未见报道。课题组前期通过对多种人参皂苷结构式和生物合成途径的研究和分析，推测MR2生物合成最后一步的糖基化反应是由其特定的UGT（PvfUGT1和PvfUGT2）催化的。本项目将基于越南人参变种的转录组数据和比较转录组分析，获得越南人参变种的UGT基因，原核和酵母表达检测UGT基因催化底物的特异性，验证基因功能；并利用real-time PCR方法检测UGT基因的时空表达模式，明确UGT基因的表达模式以及外源处理对其表达的影响。以期能够解析MR2完整的生物合成途径，为利用分子育种技术培养高奥克梯隆型皂苷人参属植物提供理论依据，也为利用合成生物学方法生产MR2奠定基础。

珠子参苷R2（MR2）为达玛烷型人参皂苷中的奥克梯隆醇型皂苷，是越南人参变种（P. vienamensis var. fuscidiscus，俗称野三七）的主要活性成分，具有抗癌，抗炎，肝保护等多种生理活性。但MR2的生物合成途径还不明确，尤其是催化最后一步糖基化反应的关键酶糖基转移酶（UGT）研究，尚未见报道。本研究首先探究了MR2在野三七中的空间积累规律，结果表明仅在野三七的主根和芦头中检测到了MR2，茎、叶和果实中未检测到珠子参苷R2。其次，本研究基于前人的研究结果推测了MR2的生物合成路径，在比较转录组中共注释到可能参与野三七中达玛烷皂苷生物合成的基因519条，基于同源序列比对、网络共表达分析、糖基转移酶( UGT)家族系统发育树分析等策略进一步缩小了候选基因的范围，最终筛选出候选基因20个，其中UGT 6个。此外，基于qRT-PCR技术，探究了MejA对MR2合成的影响，本研究探究了20个候选基因在不同组织中的空间表达模式及 MejA处理后在不同组织中的表达模式，结果表明MR2合成路径上的大部分基因均响应 MejA的调控，表达量有2-80倍的上调，推测 MejA促进了野三七中达玛烷型皂苷的生物合成。最后，为验证MR2生物合成中UGT的功能，本研究对候选UGT进行了生物信息学分析，并将候选基因从cDNA文库中克隆，连接到原核表达载体pET28a上，获得重组质粒，将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，使用IPTG诱导表达目的蛋白，并通过Ni柱亲和纯化获得了目的蛋白, 通过体外酶促反应证实Pvf04G000244和Pvf05G012959参与了MR2的生物合成，为其合成途径解析及全酵母合成奠定了基础。本研究首次对奥克梯隆醇型皂苷中糖基转移酶（UGT）进行了功能表征，项目的研究结果有助于分析MR2的完整生物合成途径，为利用合成生物学方法生产MR2奠定了基础。