肠道细菌易位：实验性军团菌肺炎小鼠多脏器损伤的核心机制？

军团菌肺炎病死率高，死因多为急性呼吸窘迫综合症(ARDS)或多器官功能障碍综合症(MODS)，但具体机制不清。本项目申请者首次发现在军团菌肺炎小鼠的肝肺分离出了非军团菌的其他细菌，提示有可能发生了肠道细菌易位。肠道细菌易位导致的炎症介质瀑布效应是MODS和ARDS发生的重要原因。结合临床表现及基础研究的成果，本项目提出如下假说作为研究目标：军团菌肺炎时发生了肠道细菌易位；肠道细菌易位与脏器损害有关；γ-干扰素是军团菌肺炎肠道细菌易位中重要的细胞因子。研究内容：①通过对军团菌肺炎小鼠血液及肝脾肾肺细菌培养、血清内毒素测定、血液细菌DNA扩增及测序，明确军团菌肺炎时发生了肠道细菌易位；②通过测定肝肾功能、观察组织病理学变化，分析肠道细菌易位与脏器损害的关系；③通过γ-干扰素的测定、γ-干扰素mRNA的基因表达、γ-干扰素基因敲除小鼠模型，探讨γ-干扰素在军团菌肺炎及肠道细菌易位中的作用。

军团菌肺炎病死率高，肠道细菌易位可能参与了其发病机制。本项目拟揭示军团菌肺炎发生了肠道细菌易位及其对机体的影响。完成的实验并得到的结果如下：1. 成功制备军团菌肺炎模型：用ACE肉汤培养军团菌进行增菌，小鼠气管内注射2×105CFU的细菌。2. 揭示肠道细菌易位的现象：将军团菌肺炎小鼠肺脏、肝脏、肾脏、脾脏匀浆液进行细菌培养，研究发现实验组小鼠20只共有8只于肺、肝组织培养出了大肠杆菌，有2只培养出金黄色葡萄球菌，提示军团菌肺炎的小鼠可能发生了肠道细菌易位。 3. 证明易位的细菌来自肠道的实验： 1）成功制备小鼠肠道细菌示踪模型：以耐氨苄青霉素的PUC19质粒作为示踪剂，转化到感受态的DH-5α大肠杆菌中，通过氨苄青霉素培养基及蓝白试验筛选出转化成功的大肠杆菌。经胃管给小鼠肠道接种转化的DH-5α大肠杆菌107CFU，用含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基培养动物粪便证实PUC19质粒载体菌在肠道内定植。2）证明易位的细菌为肠道来源：将肠道定植了DH-5α大肠杆菌的小鼠制备成军团菌肺炎模型。组织中分离出的耐氨苄青霉素细菌与肠道分离的细菌具有相同的限制性DNA内切酶酶切图谱，证明易位细菌来自肠道。4. 军团菌肺炎动物模型内毒素水平测定：实验发现军团菌肺炎组发生肠道细菌易位的小鼠内毒素水平较未发生易位组升高，有统计学差异。 5. 肝脏、肺脏组织细菌PCR测定：将肝脏、肺脏匀浆液标本提取DNA，并应用PCR方法扩增16S rRNA，将测序结果与GeneBank细菌基因组进行对比以鉴定菌型。PCR扩增提示有14只小鼠的肺组织、肝脏组织呈阳性，经序列分析，提示为大肠杆菌、柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌，与培养结果基本相符。6.临床军团菌肺炎病例继发二重感染现象：对临床军团菌肺炎病例进行分析， 15例军团菌肺炎中有2例合并其他细菌感染。7.丁香酚和肉桂醛对军团菌的抗菌活性：研究发现丁香酚、肉桂醛对嗜肺军团菌具有较强的抗菌作用。丁香酚对军团菌生物膜形成及生物膜内的军团菌具有较强的抑制作用，可降低肺内军团菌的负荷量，降低血浆内毒素水平及组织匀浆液上清炎症因子水平，并可改善致死量嗜肺军团菌肺炎的存活率。本项目研究结果揭示军团菌肺炎时会发生肠道细菌易位，继而造成二重感染，可能为病情加重的原因之一，对危重军团菌肺炎病例应关注这种继发感染。该结果对提高军团菌肺炎的治愈率、降低病死率有意义。