Polycomb 蛋白CBX4诱导细胞衰老的作用机理研究

Polycomb为一染色质修饰蛋白复合物，对于胚胎发育，细胞衰老以及肿瘤发生发挥重要调节作用。近来发现几种Polycomb成分，如CBX7，CBX8，Mel18以及 Bmi1通过结合p16INK4a locus 发挥抑制p16INK4a表达，从而逃脱细胞衰老，表现促进细胞生长的癌基因功能。 我们预实验发现，另一polycomb 蛋白CBX4 具有与之相反的效应：在细胞衰老时表达升高，过表达CBX4 上调p16INK4a，诱导细胞衰老表型提前出现。这一现象在polycomb中尚属首次发现。我们拟从现象入手，深入探索其内在机理，从其Chromodomain 与H3k27me3的结合，自身SUMO E3连接酶活性，以及CBX4调节的靶基因等多角度进行深入研究，同时找出CBX4诱导细胞衰老表型的信号通路。本研究将为深入认识Polycomb各组分的功能以及如何调节细胞衰老与p16提供重要科学依据。

细胞衰老是一种细胞周期进入不可逆阻滞的状态。在多种刺激下可以促发细胞衰老的进程。PcG 通过对衰老关键基因p16的调控参与细胞衰老的调控。前期的microarray 结果提示，在PcG 的Pc 蛋白复合体中，CBX2, 4, 6, 7, 和8在细胞衰老进程中的表达模式各不相同，其中 CBX2, 7, 和8表达下调，而CBX4, 6表达上调。为了解析这一现象，我们首先对CBX4在细胞衰老中的作用进行了研究。研究发现，过表达CBX4可以抑制细胞增殖，表现在降低BrdU掺入率、延缓细胞倍增时间、衰老相关异染色质SAHF比例增加、SA-ß-gal染色率上升等多项细胞衰老表型指标；同时，p16, p21, HMGA1,HP1γ等分子marker 表达上调，cyclin A等下调。通过稳定和瞬时转染shRNA以及siRNA.敲低CBX4，则表现出一致的细胞生物学效应，即抑制细胞增殖，表现在降低BrdU掺入率、延缓细胞倍增时间、衰老相关异染色质SAHF比例增加、SA-ß-gal染色率上升等多项细胞衰老表型指标；同时p16, p21, HMGA1,HP1γ等分子marker 表达上调，cyclin A等下调。我们分别采用ChIP assay 分析，结果发现CBX4可以结合在p16 promoter 区域，从而发挥对衰老关键基因p16的转录调控作用；同时，作为PcG的经典抑制底物HOX 基因，通过microarray我们发现只有HOXA5表现出与CBX4 负相关性，且这种负相关被过表达以及shRNA CBX4所证实，无论在RNA水平还是在蛋白质表达水平。而进一步当我们在IMR90细胞中过表达HOXA5时，则表现出明显的促进细胞衰老的表型，表现在降低BrdU掺入率、延缓细胞倍增时间、衰老相关异染色质SAHF比例增加、SA-ß-gal染色率上升等多项细胞衰老表型指标；同时，p16, p21, HMGA1,HP1γ等分子marker 表达上调，cyclin A等下调。因此我们推断HOXA5 介导了CBX4引发的细胞衰老效应。本课题首次发现在PcG复合物中对衰老双重作用的组分CBX4，同时也是首次发现HOXA5具有诱导细胞衰老的效应。除此之外，我们还意外发现了CBX4具有一可变剪接体，我们暂命名为CBX4i。并对其功能进行了初步解析。