木霉菌疏水小蛋白家族基因功能及其与根系定殖力的耦联关系

Hydrophobins (HFBs) are small secreted cysteine-rich proteins uniquely found in filamentous fungi. They have a distinct ability to self-assemble into stable amphiphilic layers at hydrophobic-hydrophilic interfaces and/or attach to various surfaces by modulating their hydrophobicity. Thus, they can be involved in a diversity of functions related to the development of the fungus and interactions with other organisms like attachment to hosts. Genome mining of the opportunistic root colonizer Trichoderma guizhouense NJAU 4742 revealed at least 10 hfb-encoding genes, what is essentially higher compared to other ascomycete fungi investigated so far. The present work is aiming 1) to study the functional genetics of HFBs in NJAU 4742 strain in order to reveal the relationships between HFBs and its root colonization via protein localization and gene edition, and 2) to find the core residues of HFBs corresponding to its hydrophobicity and the subsequent novel function by performing site-directed mutation of the putatively key amino acid.

丝状真菌的Hydropgobin（简写为HFB）是一类双亲小分子蛋白，其同时拥有疏水结构域和亲水结构域，是细胞的一种延伸结构，在真菌生长和菌丝附着基质表面过程中发挥着极其重要的作用；而拥有丰富的hfb基因是一些木霉菌株强根系定殖力的内在原因之一。本项目以木霉菌NJAU 4742为研究对象，对其hfb家族基因进行全面的基因功能解析，阐明参与根系定殖的HFB的主要生物学功能，揭示木霉菌快速适应根系环境实现菌体定殖的分子机制；另一方面，通过定点突变目标HFB特定氨基酸位点，明确影响其定殖或疏水性能的关键氨基酸残基，为实现HFB蛋白离体应用和构建具有高效定殖能力的工程菌株奠定基础。

丝状真菌的Hydropgobin（简写为HFB）是一类双亲小分子蛋白，其同时拥有疏水结构域和亲水结构域，在真菌生长和菌丝附着基质表面过程中发挥着极其重要的作用。本研究中，我们以木霉为主要模式材料，首先，针对姐妹种木霉T. harzianum（Th）和T. guizhouense（Tg）的高表达hfb基因（hfb4和hfb10）进行了基因敲除突变体库的构建，并分别对突变体进行了风媒和水媒的传播模拟试验。通过对突变子进一步的有关抗逆性、生长和繁殖能力的测试，发现HFB4的移除不仅显著影响真菌的生态适应性，且同一HFB对真菌适应性的贡献力即便在遗传背景相近的姐妹菌株间也差异显著。为解释这一现象，我们分别对两个种群的hfb4（及hfb10）进行了自然选择压力计算，发现来自Th的hfb4受到强正向选择压力的驱使。结合其生理生态习性，我们认为，Tg可能起源于水生环境，其孢子为脱离亲代生境，需要通过风媒传播至别处，且在高空中传播要求其孢子可以耐低温和UV照射，各项湿试验研究表明Tg符合上述特征要求；而Th则更偏向于利用雨水，且不排除昆虫传播的巨大可能性。.此外，在研究HFB过程中，我们在丝状真菌中找到了一条区别于其他真核生物的蛋白分泌途径，即丝状真菌在合成和分泌蛋白时多一步，其首先将蛋白大量储存于囊泡中，而非通过经典的“内质网-高尔基体“途径直接分泌。这不仅解释了像木霉这样的霉菌为何可在短时间内产生大量疏水的分生孢子用于传播，同时解释了HFB这类表面活性小蛋白在真菌基因组中富集并仅存在于丝状真菌中的生态学意义。.通过以木霉菌为模式材料，对其3个表面活性小蛋白（SSCP）家族（HFB、CP、HFS）的生物学功能及其参与植物根系定殖的作用进行研究，SSCP的大量分泌是为了更好地“改善”自身菌丝际环境以帮助菌丝完成各阶段生命所需，但并非“为植物而生”，定向改造后的HFB蛋白并不能显著改变木霉菌的定殖能力，说明菌株的定殖能力并非简单依赖于单个基因或某类基因的功能，其互作机制有待进一步研究。