调节ZEB1-EMT-MET-miR200c反馈环靶向治疗黑色素瘤CD44+CD133+CD24+CSC

肿瘤中有自我更新和分化的CSC，其是肿瘤拮抗化疗放疗、易复发与转移的主要原因。从乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等上皮来源具有高度转移的肿瘤研究发现，它们存有ZEB1-EMT-MET-miR200c反馈环，对CSC复发与转移起重要调节作用。本研究以我们已鉴定的鼠黑色素瘤B16F10细胞CD44+CD133+CD24+CSC为研究对象，将具有调节细胞增殖、凋亡及干细胞分化等功能的miR-200c和能减低ZEB1表达的shZEB1转染CSC，靶向调节ZEB1-EMT-MET-miR-200c反馈环，抑制CSC的EMT，促其MET，逆转CSC侵袭转移特性。从成球实验、EMT与MET相关蛋白检测和小鼠致瘤性等实验，分析调节该反馈环靶向治疗黑色素瘤CSC效应。本研究有望为靶向治疗黑色素瘤CSC的突破提供新方法，并为靶向治疗其它上皮来源的转移性CSC，提供可借鉴的策略，研究有重大理论意义及潜在的临床应用价值。

肿瘤中有自我更新和分化的CSCs，其是肿瘤拮抗化疗放疗、易复发与转移的主要原因。对CSCs靶向治疗，是根治肿瘤、减少化疗放疗毒副反应的有效途径。我们先前研究发现，黑色素瘤CSCs存有ZEB1-EMT-MET-miR200c反馈环，对CSCs复发与转移起重要调节作用。三年来的研究，以我们已鉴定的鼠黑色素瘤B16F10细胞的CD44+CD133+CD24+CSCs为研究对象，采用在B16F10细胞和B16F10CD44+CD133+CD24+CSCs中过表达miR200c和下调ZEB1的策略，通过一系列实验，包括划痕实验、侵袭实验检、平板克隆形成实验、体外增殖实验、耐药实验和致瘤实验进行本项目研究，具体研究概况见下： .方法：.1. 将构建的核心质粒与包装质粒psPAX2 和包膜质粒pMD2.G,通过脂质体共转染人胚肾HEK-293T细胞，并通过回收上清、超高速离心收集病毒并感染B16F10细胞，最后用极限稀释法筛选出稳定表达miR-200c细胞株；同时以pSUPER-EGFP1为载体，构建靶向鼠ZEB1的三组shRNA真核表达质粒和一组不靶向鼠任何基因的shRNA。构建4个真核重组表达载体分别命名为ZEB1-shRNA1、ZEB1-shRNA2、ZEB1-shRNA3和scramble-shRNA。.2. 用免疫磁选技术分离获取B16F10细胞以及B16F10-miR-200c细胞和B16F10-ZEB1- shRNA2中CD44+CD133+CSC。用qRT-PCR法和Western Blotting检测B16F10 细胞以及B16F10 CD44+ CD133+CSCs-miR-200c及non-CSCs中的miR-200c和ZEB1的表达。.3. 分别从细胞增殖活性、体外克隆形成能力和侵袭性及体内致瘤性等方面综合分析B16F10 CD44+CD133+CSCs中miR-200c过表达和下调ZEB1后对其生物学特性的影响。.结果：.1. 用免疫磁选技术分离获取B16F10细胞中CD44+CD133+CSCs，经qRT-PCR法和Western Blotting检测，结果显示B16F10 CD44+CD133+CSCs中的miR-200c与野生型B16F10细胞及non-CSCs相比，均显示miR-200c低表达和ZEB1高表达，差异均有显著性意义。