M-RAS可变剪接体介导的黑色素瘤靶向治疗耐药机制研究

Drug resistance presents a major clinical challenge in targeted therapy of melanoma. Alternative splicing has been recognized as a ubiquitous mechanism for promoting tumorigenesis and conferring drug resistance. Systematic investigation of alternative splicing event in cancer drug resistance will provide valuable information for the improvement of clinical efficacy and circumvention of drug resistance. We developed a novel method to detect splicing variants by reanalyzing RNAseq data of patient-matched melanoma tumors biopsies before therapy and during disease progression. Differential expression splicing variants and splicing factors were identified. We found that acquiring BRAFi resistance was mediated by M-RAS splicing variants in melanomas. MRAS has a unique function in cancers driven by oncogenic RAS mutations. MRAS mutations rarely occur in cancer but deregulated expression or aberrant splicing may play a role in tumorigenesis and drug resistance. The functions of M-RAS splicing variants will be verified by loss- and gain-of-function experiments in vitro and in vivo. We will elaborate further on the molecular mechanisms of drug resistance mediated by M-RAS splicing variants and explore novel biomarkers and therapeutic targets.

肿瘤细胞耐药是黑色素瘤临床治疗中面临的主要问题之一。可变剪接作为一种普遍存在的机制，能够促进肿瘤发生及耐药性形成。系统地针对耐药性形成中可变剪接现象进行研究与探索，能够为提高临床治疗效果、克服耐药性提供更有价值的信息。本课题开发了一种新算法用于检测可变剪接体，重新分析黑色素瘤临床靶向治疗耐药前后活检样本的转录组数据，筛选差异表达可变剪接体及剪切因子。实验验证发现RAS相关蛋白M-RAS可变剪接体参与调控黑色素瘤BRAF抑制剂耐药性形成。M-RAS在致癌基因RAS突变驱动的癌症中发挥着独特作用。癌症中M-RAS突变频率较低，其表达失控或可变剪接异常可能在肿瘤发生及耐药性形成中发挥重要作用。本研究将采用功能缺失和功能获得策略，通过体内及体外实验验证M-RAS可变剪接体在肿瘤耐药形成中的功能，解析M-RAS可变剪接体介导的靶向治疗耐药机制，挖掘新的生物学标志物及靶向治疗位点。

肿瘤细胞耐药严重制约了靶向治疗在黑色素瘤中的临床应用。可变剪接作为一种普遍存在的基因表达调控机制，能够影响肿瘤发生、发展及耐药性形成。系统地针对耐药性形成中可变剪接现象进行研究，能够为克服肿瘤耐药性提供更有价值的信息。本课题（1）开发新算法用于准确鉴定、定量可变剪接体，分析可变剪接造成的蛋白质序列变异及其功能性结果，并利用黑色素瘤临床MAPK 通路靶向治疗耐药前后活检样本的转录组数据分析鉴定耐药相关可变剪接体，发现在耐药形成中MAPK 和PI3K-AKT通路中关键因子发生显著的可变剪接变化；（2）针对M-RAS和AKT2异常可变剪接体，利用过表达及干扰技术，通过体内及体外实验验证候选可变剪接体在肿瘤耐药形成中的功能。过表达M-RAS-L和AKT2-206均能诱导黑色素瘤细胞发生耐药。M-RAS-L通过促进细胞增殖增强黑色素细胞耐药，而AKT2-206则通过同时调控细胞增殖和抗凋亡能力影响黑色素瘤细胞耐药性；（3）利用生物信息学分析结合实验鉴定出hnRNPK参与了AKT2的可变剪接过程，而两者的调控关系进一步在独立的临床样本及小鼠模型中得到了验证；（4）针对AKT2下游通路分析及验证表明，hnRNPK-AKT2通过调控p-S6水平进而影响黑色素瘤耐药过程。上述研究结果表明可变剪接在黑色素瘤肿瘤耐药中发挥着独特作用，其中hnRNPK-AKT2-S6调控轴通过调控PI3K-AKT通路活性影响黑色素瘤耐药性形成。上述结果为解析异常可变剪接介导的靶向治疗耐药机制提供了扎实的研究基础，有助于开发新的治疗靶点及方法，为实现克服黑色素瘤肿瘤耐药提供了新途径。