层析过程中界面上蛋白质结构及动态变化

层析技术是蛋白质分离纯化最为有效的手段之一，由于蛋白质结构复杂且受层析介质性质和溶液环境影响，蛋白质在吸附与解吸过程中常发生结构变化，导致被洗脱出的蛋白质存在不同程度失活现象，是近年来蛋白质层析分离研究领域的热点。本项目针对层析过程中蛋白质的失活现象，利用双偏振极化干涉测量技术探索一种研究蛋白质在介质表面上的结构及其动态变化的方法；利用界面修饰技术结合微区分析方法制备不同密度和间隔臂长度的配基，研究配基密度和间隔臂长度对界面上蛋白质结构稳定性影响的规律；在此基础上，研究不同溶液环境中蛋白质在界面吸附过程中的空间取向，探索控制蛋白质在界面吸附过程中空间取向和提高蛋白质结构稳定性的方法；结合层析分离和蛋白质活性分析，对蛋白质在界面上的结构动态变化规律和空间取向控制方法进行验证。

针对层析过程中蛋白质的失活现象，利用双偏振极化干涉测量技术（DPI）技术结合表面化学改性技术，研究了层析过程中界面上蛋白质结构及动态变化。采用三种不同类型的氨基硅烷对DPI芯片表面进行了化学修饰，采用X射线光电子能谱技术（XPS）研究了修饰前后N元素的含量，制备出不同配基密度的氨基酸硅烷修饰的DPI芯片，采用接触角等分析了修饰前后DPI芯片表面的亲疏水性。在此基础上考察了基于DPI的界面上蛋白质结构稳定性及其动态变化规律，和溶液环境对蛋白吸附层的影响。项目取得了如下主要研究结果：.（1）采用DPI技术和芯片表面化学修饰技术，通过测定吸附层蛋白质的厚度（nm）、密度（ng/mm3）和单位面积上蛋白质吸附量（ng/mm2），结合不同蛋白质分子直径（DH）建立了的研究界面吸附蛋白质结构动态变化的方法。.（2）发现配基密度和间隔臂长度是影响蛋白质吸附层结构和稳定性的关键因素，配基间距（L, nm）大于蛋白质有效水力学直径（DH, nm）时，吸附层蛋白的直径与溶液中的直径一致，蛋白质在界面上主要呈单分子层吸附，吸附层蛋白容易被洗脱；对于不同的蛋白质，界面上配基最适密度取决于相同溶液中蛋白质的直径，当层析介质表面上配基间距L > DH时有利于维持吸附层蛋白的结构，并降低活性损失。.（3）研究了蛋白质吸附过程中吸附层厚度变化的动力学，并结合蛋白质在溶液中的扩散过程，发现溶液种类和蛋白质浓度对一定配基密度表面上蛋白质吸附过程的影响，当蛋白质浓度低于临界浓度（CCrit）条件下，有利于形成空间取向均一的蛋白吸附层。蛋白质浓度影响吸附动力学常数和蛋白质吸附层的厚度及密度，高浓度条件界面上吸附蛋白质厚度小于蛋白质直径，易导致被吸附的蛋白质结构变化。.项目通过系统考察界面吸附蛋白质的变构过程和溶液环境对变构过程的影响，获得了通过外部环境控制蛋白质在界面吸附时空间取向的方法及规律，为生物大分子高效分离技术的发展提供理论依据，为研究不同层析介质对目标蛋白稳定性的影响及探索蛋白质失活机理提供了理论支持，为研制有应用针对性的层析介质奠定基础。.项目取得的主要研究成果包括：发表了6 篇学术论文，2篇核心期刊论文，4篇SCI收录论文；合作培养和独立培养研究生4名；获得了3项科技奖励，包括1项行业学会奖励，1项行业协会奖励和一项省级科技奖励；申请国家发明专利2项，授权1项。