禽致病性大肠杆菌T6SS-2效应蛋白Hcp对上皮细胞致病作用研究

An ordinary way of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) infection is through the respiratory tract. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) is important pathogen that cause serious losses to sound development of the poultry industry. Recent study showed the type VI secretion system-2 (T6SS-2) make the pathogenicity of APEC more complex, while the pathogenicity and mechanism of T6SS-2 effector protein on chicken tracheal epithelium cell is unclear. To research the pathogenic mechanism of Hcp in the APEC isolated strain named AE17, which is isolated in our group, we construct APEC-Hcp mutant strain with red recombination system and evaluate its biological characteristics. The chicken tracheal epithelium cell and chick model infected through trachea are used to observe pathogenic mechanism of Hcp in tracheal epithelium cell. Furthermore, iTRAQ phosphorylation technique is used to verify phosphoprotein effected by Hcp. All the studies are to reveal the pathogenicity of APEC-T6SS-2 effector protein Hcp, and provide not only more effective application foundation for anti-infection through T6SS-2 as the main target, but also provide a new perspective for the prevention and treatment of APEC.

禽致病性大肠杆菌（APEC）通过呼吸道途径感染，是严重危害养禽业健康发展的重要病原菌。新近研究发现VI型分泌系统-2（T6SS-2）使APEC的致病性更加复杂，但T6SS-2效应蛋白Hcp对鸡气管黏膜上皮细胞的致病作用及机理尚不清楚。本项目利用实验室APEC分离株（AE17），研究T6SS-2效应蛋白Hcp的致病作用。拟通过Red同源重组的方法构建Hcp缺失株并对其进行生物学特性评价；利用鸡气管黏膜上皮原代细胞和雏鸡气管感染模型，研究效应蛋白Hcp在气管黏膜上皮细胞致病中的作用；进一步采用iTRAQ磷酸化修饰定量技术确定T6SS-2效应蛋白Hcp引起差异表达的磷酸化蛋白，揭示APEC T6SS-2效应蛋白Hcp致病作用，为探寻以T6SS-2为主要靶点的宿主抗感染提供切实的应用基础，进一步为防治APEC感染提供新思路。

为了研究禽致病性大肠杆菌T6SS-2效应蛋白Hcp对宿主的致病作用，本研究首先构建了hcp基因缺失株和clpV基因缺失株以及回复株，对突变菌株进行生物学特性和毒力检测。通过原核表达方式，分离纯化出Hcp2a和Hcp2b蛋白，制备出Hcp蛋白多克隆抗体。建立了雏鸡气管感染模型，感染hcp基因缺失株、clpV基因缺失株后，进行病理切片制备、转录组测序和定量蛋白质组学分析致病机制。在此基础上，构建效应蛋白Hcp2重组真核表达载体，利用激光共聚焦显微镜，分析了效应蛋白Hcp2在细胞中的亚细胞定位。进一步通过高通量转录组学和定量蛋白质组学测序，开展了效应蛋白Hcp2对细胞信号通路活化的作用研究。结果发现hcp基因和clpV基因缺失后影响APEC的生物学特性，利用建立的雏鸡气管感染模型，采集气管组织制备病理切片，结果显示AE17感染后气管、肝脏、脾脏、肺脏均有不同程度水肿、充血和异嗜性粒细胞浸润现象，气管黏膜上皮细胞差异mRNA主要富集在炎症和细胞周期相关通路。感染hcp以及clpV基因缺失株及其回复株，缺失株△hcp2a和△hcp2b在肝、脾、肺、肾载菌量显著降低。转录组测序发现hcp以及clpV基因缺失引起宿主气管黏膜上皮细胞转录组的变化，差异基因富集在一些重要通路。检测hcp2a、hcp2b缺失后对雏鸡气管黏膜上皮细胞蛋白质组学的影响，hcp2a、hcp2b缺失后影响宿主细胞蛋白质组学，差异蛋白主要富集在TGF-β信号通路等通路。使用纯化的Hcp2蛋白加入细胞中，通过间接免疫荧光试验和细胞器荧光探针标记，激光共聚焦显微镜观察Hcp2蛋白亚细胞定位。结果表明，Hcp2a和Hcp2b两种蛋白可以透过细胞膜进入胞内，并且呈现出聚集形式，且Hcp2a蛋白和Hcp2b蛋白与内质网均有明显的共定位现象。以上结果表明，T6SS-2效应蛋白Hcp对鸡气管黏膜上皮细胞有着关键的生物学功能调控作用，为进一步探究Hcp2蛋白对宿主细胞分子致病机制提供重要依据。