靶向宿主细胞CSGalNAcT-1蛋白抗HCV药物先导物木豆素的化学蛋白质组学研究

The discovery of novel cellular targets for anti-HCV agents is highly desirable for combating drug resistance and discovery of pan-genotypic anti-HCV agents. Our previous studies showed that cajanine possessed potent inhibitory activity against HCV replications, and exhibited the same magnitude of inhibitory activity against both the wild-type and drug-resistant HCV. In addition, cajanine also synergistically inhibited HCV replication with approved DAAs. Furthermore, the mechanism of action study revealed that cajanine inhibited HCV replications via down-regulating a cellular protein chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1(CSGalNAcT-1). However, the protein(s), which physically bind to cajanine, remains to be clarified. Consequently, we propose to find out such protein(s) by employing chemoproteomics strategy and illustrate the relationships of such protein(s) with the replication of HCV virus and the degradation of CSGalNAcT-1. The completion of this project will yield novel cellular targets for the discovery of new anti-HCV agents, and meanwhile, will enhance our understanding of the HCV-host interactions, and thereby provides new clues for the development of HCV vaccine.

新宿主细胞靶标的发现对于对抗HCV耐药以及研发新型泛基因型抗HCV药物具有十分重要的意义。申请人前期研究中发现木豆素具有明显的抗HCV病毒活性，而且其对HCV 耐药株均体现出了与野生株相当的活性，与直接作用于病毒的抗HCV药物联用也体现出了对HCV病毒复制抑制的协同效应。初步的作用机制研究发现木豆素对常见病毒蛋白均无明显抑制作用，而是通过加速宿主细胞硫酸软骨素N-乙酰氨半乳糖胺基转移酶1（CSGalNAcT-1）的降解来抑制HCV病毒的复制。但是，与木豆素直接结合的宿主细胞蛋白还不得而知。因此，本课题拟采用化学蛋白质组学策略，找到直接与木豆素结合的蛋白，阐明这（些）蛋白与HCV病毒复制以及CSGalNAcT-1蛋白降解之间的关系。从而为新型泛基因型抗HCV药物的研发提供新靶标，并同时能加深我们对病毒和宿主细胞相互作用的了解，从而为HCV疫苗的研发提供新思路。

新的抗病毒宿主细胞靶标的发现对抗HCV耐药以及研发广谱抗病毒药物具有重要的意义。本项目前期研究发现木豆素及其衍生物具有明显的抗HCV病毒活性，对不同基因型以及耐药病毒也体现出相当的抑制活性。作用机制研究发现木豆素对病毒蛋白均没有明显的抑制作用。猜测其可能靶向宿主细胞蛋白。本课题首先基于木豆素的骨架，合成了多个光交联以及具有共价键形成能力的探针，结合蛋白pull-down和蛋白质组学策略，研究直接与木豆素结合的蛋白。但是，这些策略均未能找到与木豆素特异结合的蛋白。随后，本项目采用基于药效团筛选的策略，找到多个与木豆素潜在结合的宿主细胞蛋白，并通过体外模型验证木豆素对CDK6, CDK9, BRD4, GSK-3beta, JNK1, p38alpha体现出中等强度的抑制活性（IC50 = ~ 15 uM）。这些蛋白均对病毒的复制起到关键的作用。鉴于木豆素靶向宿主细胞的特性，木豆素对冠状病毒，流感病毒，疱疹病毒等也体现出一定的抑制活性。但是，由于木豆素结构的疏水性，导致其作用靶点的杂泛性，成药性较差。因此，本项目还进一步通过骨架跃迁的策略，设计合成了具有喹唑啉骨架的抗病毒先导物，并对其进行了系统的结构优化，同时在体外评价了对冠状病毒的抑制活性。结果显示，喹唑啉类衍生物对冠状病毒体现出较强的抑制活性（IC50 < 1.0uM），代表化合物对SARS-COV-2也体现出了一定的抑制活性。作用机制的研究发现，喹唑啉类衍生物与木豆素一样，同样作用于CDK6, 9、BRD4宿主细胞蛋白。但是，非常有意思的是，不同于木豆素的抑制活性，喹唑啉类衍生物激活了这些蛋白。而喹唑啉类衍生物是否通过激活这些蛋白来抑制病毒的复制还有待进一步的研究。总之，本论文通过化学蛋白质组学等技术找到了木豆素作用的多个抗病毒宿主细胞靶点，并通过骨架跃迁等策略设计合成具有全新骨架、更具成药性的喹唑啉类抗病毒先导化合物，为抗病毒尤其是冠状病毒的药物研发提供了新的先导化合物，同时也为抗病毒药物设计提供了新的潜在宿主细胞靶点。