天然药物靶标发现的化学蛋白质组学新技术

Natural product is one of important sources for novel drug development. However, most of their targets remain unknown due to current technical limitations, which obstructs structural transformation and has become a bottleneck for further development. The weak binding between drug and its target protein is the major problem as it would be easily broken during detection. In this proposal, we suggest to develop a novel technique by combining Native-Mass Spectrometry (MS) with Desorption Electrospray Ionization (DESI) for direct detection of drug-protein complexes, which maintains weak bindings connected during detection. In addition, the establishment of online enzymatic digestion-assisted structural analysis is suitable for non-denaturing systems, which mimics the conformational states of complexes in cells or organisms and achieves dynamic analysis of binding sites. Finally, chemical crosslinking provides validation and quantitative analysis of binding sites and conformational changes. Therefore, the development of this proposed techniques would benefit for target discovery of natural drugs, especially for maintaining drug-target protein weak bindings during detection, which promotes the discovery of novel drug innovation and their target discovery.

天然药物是创新药物研发的重要来源，但受限于技术瓶颈，天然药物靶标发现十分困难，严重限制了基于天然药物的创新药物研发。天然药物与靶蛋白的弱结合性，导致复合物在检测过程中易被破坏，是天然药物靶标发现的核心难点问题。本项目拟建立非变性质谱与解吸附电喷雾电离源串联新技术，突破药物-靶蛋白弱结合带来的检测困难，实现直接检测复合物质谱信号；建立非变性体系的在线酶切辅助靶标鉴定新技术，还原复合物在生物体内的结构状态，依据酶切效率受蛋白碰撞几率及结构的影响原理，实现对药物-靶蛋白结合位点的动态分析；建立化学交联技术进行结合位点的验证及定量检测。项目研究将为天然药物靶标发现特别是弱结合靶蛋白的发现提供共性技术，助推基于天然药物的创新药物研发和新靶标的发现。

天然药物靶标发现对该类药物后续研发及分子机制研究具有重要意义。然而传统检测方法易破坏天然药物与其靶标间弱结合，缺乏两者间结合的直接证据。同时在复杂生物基质背景下的药物靶标发现过程中，受内源性物质的干扰，易错失低丰度靶蛋白。此外，现有方法多用于药物与候选靶蛋白间结合模式的验证，缺乏对靶蛋白的发现和筛选能力。因此，本项目以“药物靶标发现-筛选-结合模式评价”为核心建立了系统的方法学体系，为基于天然药物的靶标发现和创新药物研发提供共性技术支撑。本项目首先结合传统解吸附电喷雾电离技术，构建了原态-变性转换离子源，其独特的样品与解吸附溶剂双通道进样模式有利于维持配体-靶蛋白间弱结合，该离子源的建立突破了非共价结合分析难点，提供配体-靶蛋白结合的直接证据。同时，该进样模式可兼容复杂混合物体系，实现了多配体/多靶蛋白存在下的高通量特异性筛选。在此基础上，通过逐步提升解吸附溶剂流速，梯度增大电喷雾中变性试剂比例，实现配体-靶蛋白电离环境由原态到变性状态的连续转变。基于“配体特异性结合具有靶蛋白构象依赖性”假说，发现在此过程中，仅特异性结合的配体-靶蛋白复合物质谱信号逐渐下降，同时Kd值变化与流速呈线性关系。由此，通过配体-靶蛋白复合物质谱信号与流速变化间规律实现了两者间结合模式的准确鉴别，以及对与药物特异性结合的靶蛋白的分析与筛选。在此基础上，与分子排阻色谱串联可降低细胞样品复杂性，快速准确地从复杂细胞裂解液中筛选与目标配体特异性结合的靶蛋白。最后，结合纳米粒子技术，将目标药物共价修饰在磁性纳米粒子表面，利用其比表面积大的优势，提高对复杂基质中低丰度靶蛋白的结合效率。同时通过磁性富集，实现药物-靶蛋白复合物与内源性干扰物质的完全分离，提高了后续靶蛋白检测和鉴定的灵敏度。由此，本项目建立了具有普适性的药物靶标筛选方法学体系。