外周血T细胞DNA甲基化在乳腺癌早期诊断中的分子流行病学研究

Early diagnosis can improve the survival of cancer and save the cost for public health. However, so far there is no sufficient biomarker for the early diagnosis of breast cancer in-vitro. Recent studies have reported the association between peripheral blood DNA methylation and tumor initiation and development. Our previously studies have showed the significant change of DNA methylation in the peripheral blood T cells of breast cancer patients. Hereby, this project will perform epigenome-wide association study (EWAS) using Illumina 450K DNA methylation array to investigate early breast cancer associated DNA methylation signatures in peripheral blood CD4 T cells and CD8 T cells. The methylation sites which are also discovered in the peripheral blood DNA of breast cancer patients by previous study will be filter out. Finally, the selected DNA methylation sites will be validated by MALDI-TOF mass spectrometry in peripheral blood DNA samples from 250 early breast cancer patients and 250 controls. The potential of peripheral blood DNA methylation for the early diagnosis of breast cancer will be evaluated and the correlation between peripheral blood DNA methylation and clinical characteristics of breast cancer will also be investigated. This study will address the origin of breast cancer associated peripheral blood DNA methylation from which T cell subtypes, and therefore provide further evidence for peripheral blood DNA methylation signatures as novel in-vitro biomarkers for cancer early diagnosis. Moreover, this study will provide new insight for the mechanism study on the interaction between tumor and systematic immune response.

早期诊断可提高癌症患者的生存率并节省社会医疗开支，但目前尚无有效的乳腺癌早期诊断体外分子标志物。最新研究发现外周血DNA甲基化水平跟肿瘤的发生发展相关。我们的前期工作显示，乳腺癌患者的外周血T细胞DNA甲基化水平有显著变化。据此，本课题将通过Illumina 450K DNA甲基化芯片进行EWAS表观组研究，对早期乳腺癌相关的外周血CD4 T细胞和CD8 T细胞DNA甲基化进行分析，并与前期工作中发现的乳腺癌相关外周血DNA甲基化位点交互检测并逐级筛选，最后将选定的甲基化位点通过飞行时间质谱在250例早期乳腺癌患者和250例对照的外周血DNA中进行验证，并分析外周血DNA甲基化水平对乳腺癌早期诊断的临床价值及与乳腺癌临床特征的相关性。这项研究将阐明乳腺癌相关的外周血DNA甲基化来源于哪种T细胞亚型，为这种新型肿瘤分子标志物提供进一步的佐证，并为肿瘤与机体免疫交互作用的机制研究提供新的思路。

本研究首先揭示了血液处置的时间和温度以及多次冻融对样本DNA甲基化的影响，从而制定了DNA甲基化研究中标本的处置标准。基于上述样本处置标准及半定量的MassARRAY DNA甲基化检测技术，我们进行了以下乳腺癌甲基化相关的研究：.在中国人群中通过病例对照研究验证了既往在欧美人群中报道过的外周血HYAL2，S100P，RAPSN，RPTOR和EMR3的异常甲基化跟乳腺癌的相关性。除了EMR3的乳腺癌相关甲基化改变方向相反以外，其他四个乳腺癌相关基因均显示跟欧洲人群相同的低甲基化。但乳腺癌相关基因的具体甲基化位点及甲基化强度跟欧洲人群有所差异。因此外周血DNA甲基化可能存在种族或者生活习惯导致的异质性。提示在中国人群中开展表观遗传关联研究或者至少开展有效验证的必要性。另外，我们还发现DNA甲基化跟乳腺癌的受体类型有关，且年龄对于病例和对照的DNA甲基化有不同程度的影响，由此揭示了可能存在的甲基化的精密调控。.目前国内外对于早发性乳腺癌遗传易感性的关联研究少见，对其表观遗传关联研究则更缺乏。我们首次发现亚洲女性早期乳腺癌与外周血PTCH2高甲基化显著相关，且主要在≤35岁的乳腺癌患者中。PTCH2基因甲基化可能是一种新的乳腺癌早诊分子标志物，有潜在的临床应用前景，并因此申请了专利。.EWAS组学研究和MassARRAY技术被用于探索和验证乳腺癌相关的外周血循环CD4和CD8 T细胞DNA甲基化。首次发现主要来自于T细胞的Gene_K的低甲基化与乳腺癌的发病风险显著相关，且与ER阴性、PR阴性、HER2阳性、三阴性乳腺癌，有淋巴结转移的病例显著相关。此外我们还发现主要来自于T细胞的Gene_O的高甲基化与乳腺癌病例PR受体阳性有显著的关联。Gene_K和基因O的甲基化可能是新的乳腺癌早诊分子标志物。.综上，我们的研究为外周血DNA甲基化标志物这种新型癌症早诊标志物提供了更多的依据，并为肿瘤与机体免疫的机制研究提供新的方向。后续研究还将继续发现更多的DNA甲基化标志物，建立乳腺癌早诊评估模型，并在队列多中心研究中评估该模型的临床价值。