细胞膜蛋白样品制备新方法及其在发掘NgBR相互作用蛋白中的应用

To solve the problem how to keep stability of the protein complex during increasing the solubility of membrane protein, we will develop the new method for preparing the tumor cell membrane protein samples by optimizing the detergents mixture used in the cell lysis buffer to increase the solubility of membrane protein as well as using formaldehyde to keep the stability of membrane protein complex. By using the new established membrane protein preparation method combined with the SILAC and LC-MS/MS quantitative proteomic technique, we will determine the tumor membrane proteins interacting with NgBR, a new membrane scaffold protein involved in tumorigenesis. In addition, we will use the biological approaches to validate these interacting proteins identified by proteomics. Results from proposed studies will provide a novel technique for elucidating the NgBR signal pathway and the molecular mechanism of NgBR biological function.

针对蛋白质组学在研究细胞膜蛋白-蛋白相互作用时，细胞膜蛋白难以在提高溶解度的同时并保持其复合体稳定性的问题，本课题拟通过调整非变性表面活性剂分子组合提高细胞膜蛋白溶解度，并利用化学小分子甲醛稳定细胞膜蛋白复合体稳定性，以建立有效获得肿瘤细胞膜蛋白复合体的制备方法。利用该方法联合SILAC技术和基于LC-MS/MS的蛋白质组定量策略，发掘细胞膜蛋白分子NgBR的相互作用分子，并对发现的相互作用蛋白分子进行生物学验证。为阐明NgBR参与的细胞信号通路及发挥生物学功能的分子机制提供技术支撑。

细胞膜蛋白在细胞内外物质交换、信号转导及能量传递等诸多生物过程中都起着关键作用，细胞膜蛋白的研究已成为蛋白质组学研究领域的热点和难点之一。细胞膜蛋白通常是需要通过蛋白-蛋白相互作用形成大的复合体而发挥生物学功能。蛋白质间的相互作用存在于生物体每个细胞的生命活动过程中，相互交叉形成网络，构成细胞中一系列重要生理活动的基础。目前制约利用蛋白质组学技术来研究细胞蛋白-蛋白的相互作用的瓶颈在于如何在样品制备的过程中保持这些蛋白-蛋白复合体的完整性，特别是针对丰度低、疏水性强、水溶性差的细胞膜蛋白相互作用复合体。NgBR是一个特异的Nogo-B 细胞膜蛋白质受体，研究表明该受体在血管内皮细胞迁移过程中发挥着重要功能并参与了斑马鱼小血管的发育过程。NgBR相互作用蛋白的研究尚处于起步阶段，因此利用更先进、有效的蛋白质组学技术发掘细胞膜蛋白NgBR相互作用蛋白对阐明NgBR参与的细胞信号通路及发挥生物学功能的分子机制具有重要意义。针对这些问题，本课题拟建立细胞膜蛋白质高效提取的同时不破坏细胞膜蛋白复合体的高效提取方法；并发掘NgBR相互作用蛋白分子，阐明NgBR参与的信号通路及发挥生物学功能的机制。在本研究中我们实现了利用离子液体高效获取细胞膜蛋白质，并利用化学交联剂稳定细胞膜蛋白质复合体，并利用蛋白质组学质谱技术解析了NgBR相互作用蛋白，同时利用生物学方法研究发现NgBR可以通过激活Ras/Akt/MDM2信号通路抑制p53蛋白的泛素化，进而导致肝癌耐药性，提示细胞膜蛋白NgBR可以作为潜在的提高肝癌化疗药物治疗敏感性的靶点。