新型高效基因启动子多个CpG位点甲基化同时定位定量液相检测方法研究

基因启动子重要CpG位点甲基化在肿瘤发生发展及药物反应中发挥关键作用，是重要的分子遗传标识。其检测对肿瘤预警、早期发现与个体化医疗具重要价值。传统甲基化检测方法不能多个CpG位点同时定位定量，繁琐低效，严重阻碍了肿瘤预警与个体化医疗进程。一步完成通常多步进行的检测和生化反应并多个CpG位点定位定量是创新检测方法的根本途径。本题拟在前期成功建立分步扩增、杂交反应和数字化同步检测靶分子分子量与荧光信号的液相检测技术的基础上，研究一步完成非对称兼并扩增、多重杂交联合反应和多个CpG位点同时定位定量荧光偏振增强液相检测分析技术，整和两者，建立生化反应和检测分析技术双重高效的基因启动子多个CpG位点甲基化同时定位定量液相检测方法。该法简便、全面准确、性价比高，将为基因启动子甲基化检测研究开辟新策略，为研发国产化高通量高效基因启动子甲基化定位定量液相检测产品奠定研究基础，促进肿瘤预警与个体化医疗发展。

重要基因启动子CpG位点甲基化分子标识检测为恶性肿瘤预警及预见性治疗提供关键依据。本课题研究了一步完成、定量非对称兼并扩增多重杂交联合的高效基因启动子CpG位点甲基化荧光偏振检测方法。以重要肿瘤预警基因p16INK4a, EGFR，MGMT启动子CpG位点甲基化检测为切入点，应用一对通用引物和甲基化、非甲基化特异探针进行非对称兼并扩增、多重杂交联合检测反应，荧光标记分子分子量及荧光偏振FP值随CpG位点甲基化状态、数量变化而显著变化。本课题观察了反应条件的影响，研究了杂交反应中能敏感、稳定特异识别CpG位点的最佳探针的设计规律，阐明了多重杂交反应的条件规律。建立了新型高效定量DNA甲基化荧光偏振检测方法，获得较高的优越性。. 首先，本方法具有简单便捷和高效快速的优越性。甲基化序列特异探针和未甲基化序列特异探针可以同时分别杂交，从而等位基因启动子甲基化与非甲基化可以同时检测。与单独检测反应相比，同时检测甲基化与非甲基化等位基因的反应更加精确。反应中，非甲基化等位基因既作为靶基因也作为靶基因质控内参，简化了内参设定和精确定量模板的需求。建立了标准曲线，待测样本与荧光偏振FP值标准曲线比较即可检测判断甲基化数量。. 第二，本方法具性价比高，成本低的优越性。传统的DNA甲基化检测法中，需双荧光标记TaqMan探针和高精度实时荧光强度检测设备。本方法则应用更低合成费用、更低工作浓度的单端标记探针-5’末端荧光标记探针和无3’外切活性的普通DNA聚合酶，无需荧光萃灭，成本大大降低，不需任何特殊仪器设备，应用普通荧光偏振读数板即可完成检测。同时，本法在液相中对甲基化与非甲基化等位基因进行测定，效率显著提高，可实现大量临床样本高通量并行快速DNA甲基化检测分析。. 第三，本方法具较高敏感精确性和稳定重复性优越性。该方法不依赖起始靶基因模板数量，能够敏感检测模板中低浓度的靶基因甲基化水平；该方法检测水平与垂直两个方向的荧光强度比值-荧光偏振，不依赖荧光强度，敏感度提高。而且，同时检测多区域多CpG位点可靠性强，在甲基化与非甲基化等位基因杂交状态检测中能获得更可靠结果。. 同时，本题进行了基因型与基因变异的非对称扩增杂交的新型高效生化反应研究，建立了一步完成新型高效多基因型与基因变异的液相荧光偏振检测方法。为今后研究配套技术和配套产品奠定理论基础