糖诱导微藻油脂合成的代谢通量分析

微藻油脂合成与微藻生物柴油炼制是现代生物能源研究的热点课题。申请者以往的研究证明，微藻光合自养利用太阳能和CO2，可改善环境并降低原料成本，加糖异养有利于油脂含量和细胞密度的大幅增加。本项目在建立先光合自养后化能异养的微藻细胞动态变化实验模型基础上，针对糖诱导微藻油脂合成过程，以系统生物学思路和平台技术开展微藻生物能源热点课题的基础理论研究。即主要利用代谢通量分析技术，结合蛋白质组学、关键基因转录和能荷变化分析，研究微藻自养－异养转化过程中糖诱导微藻油脂合成的基本途径和相关代谢通量的分布，认识异养转化中代谢网络的物质和能量转化过程，发现与异养代谢过程中糖－脂转换相关的基因及其调控机理，为减少糖的消耗和改进微藻油脂合成及微藻生物柴油炼制提供依据。该研究体现了基础科学研究的原始创新性，对于发展生物质能源，满足国家能源需求和促进国民经济的可持续发展等具有良好应用前景。

在先光合自养后化能异养的微藻细胞动态变化实验研究基础上，探索糖诱导微藻油脂合成及提高微藻油脂产率的问题。取得主要研究成果包括：在9种不同两步营养细胞培养模式中,先自养后异养模式经葡萄糖加入后最大程度地提高了油脂合成的产率，验证了所建立的C. protothecoides 0710的自养－异养转化细胞动态实验模型是增加微藻油脂产率最有效技术；响应面分析发现，限氮对于控制C. protothecoides 0710细胞吸收葡萄糖、细胞绿-黄颜色表型及油脂合成速率变化起了关键性的作用。C. protothecoides 0710细胞能否吸收葡萄糖进入异养生长及细胞内的叶绿素能否完全消失，并不仅限于所提供葡萄糖的浓度，还受控于培养液中C/N值（有机碳源与氮源的比值）；蛋白质组动态变化分析揭示了自养向异养代谢转换过程中从葡萄糖到油脂合成过程关键蛋白变化的信息，进一步与刚完成的该藻株全基因组测序结果做对照，从分子水平上探讨了该藻株高油脂产率的原因及油脂合成代谢规律，也为今后开展微藻油脂代谢的分子生物学分析、代谢工程改造等创造了条件；通过代谢通量分析建立了异养微藻油脂合成中心碳代谢相关数学模型并描述了异养过程的糖－脂转换相关的中心碳流量分布和能量转换过程；抑制性消减杂交文库筛选出自养向异养转化中差异表达的基因，其中编码铵转运蛋白基因(CpAMT1)显著性上调；但向糖诱导转化系统加入谷氨酰胺，该基因的上调被抑制，同时伴随着油脂合成的延迟。说明铵转运蛋白与油脂合成之间存在正向的联系, 铵转运蛋白基因(CpAMT1) 可能是葡萄糖吸收促进油脂合成过程中限氮信号最初的受体。新建立的光合自养偶联异养发酵的微藻“光合－发酵模型”（Photosynthesis－fermentation Model，缩写PFM），将C. protothecoides 0710的油脂产率比纯异养更提高了近3倍，两次二氧化碳固定是该模型油脂产率提高的原因，该假说得到了实验进一步验证。