基于ROS—线粒体途径探究液态保存中奶山羊精子凋亡机理

Liquid storage of semen is the key technology of improving breeding in dairy goats. Nevertheless, the short storage time and rapid decline of sperm motility limit the application of liquid storage. Therefore, clarifying the major factors affecting the liquid storage of semen is necessary. Our previous studies have revealed that sperm apoptosis is one of the important mechanism to affect the sperm storage in liquid. Notably, ROS-mediated mitochondrial pathway may paly vital roles in the liquid storage of semen, whereas its underlying regulatory mechanisms are still unclear. In this study, to explore the molecular processes of ROS triggering the mitochondrial pathway and then regulating dairy goat sperm apoptosis during liquid storage, both positive and negative experiments are employed. At the cellular and molecular levels, (1) the process of ROS inducing sperm apoptosis during liquid storage will be understood, (2) and the mechanism of mitochondria oxidative damage by ROS resulting in sperm apoptosis will be clarified. (3) Furthermore, the critical proteins related to ROS triggering mitochondrial pathway will be identified. Then the dynamic processes of ROS activating mitochondrial pathway through critical proteins and then inducing sperm apoptosis will also be uncovered. The results will contribute to illuminate the cellular and molecular mechanism of sperm apoptosis during liquid storage from the point of ROS-mediated mitochondrial pathway, and will provide theoretical enlightenment and insights into the development of semen diluent formula and long-term sperm storage method in liquid.

精液液态保存是加速奶山羊良种扩繁的关键技术，但液态保存时间短、精子活力下降快等问题极大限制了该技术的应用，因此迫切需要明晰影响液态保存效果的关键因素。课题组前期研究表明，凋亡是影响奶山羊精液液态保存质量的一项关键生理机制，其中ROS介导的线粒体途径可能发挥重要调控作用，但具体机理尚不清楚。为探究液态保存中ROS对线粒体途径的激活作用以及对精子凋亡的影响，本项目拟设计正反向实验，在细胞和分子水平上，（1）明确液态保存过程中ROS对奶山羊精子凋亡的诱发作用；（2）探明ROS引起的线粒体氧化损伤，进而分析ROS损伤线粒体诱导精子凋亡的作用机理；（3）进一步筛选鉴定ROS激活线粒体途径的关键蛋白，明晰ROS通过关键蛋白激活线粒体途径，诱导精子凋亡的动态过程。研究结果将从ROS—线粒体途径的角度阐明液态保存中奶山羊精子凋亡的细胞分子机理，为保存稀释液配方的研发以及长效保存方法的建立提供理论支撑。

奶山羊精液液态保存具有操作简便、利于运输、无冻融损伤等优点，是精液保存较理想的方式。但液态保存时间短、精子活力下降快等因素极大限制了该技术的发展和推广，因此迫切需要明晰影响液态保存效果的关键因素。本研究在奶山羊精液中添加ROS诱导剂或清除剂进行4℃液态保存，发现液态保存中过量ROS可导致精子活率、质膜完整性和精子运动能力的显著下降；扫描电镜与透射电镜观察显示，过量ROS可导致精子顶体破损、头颈连接处断裂、线粒体肿胀等超微结构损伤，同时精子出现核膜膨胀折叠、核表面针状突起、核崩解碎裂等典型凋亡形态特征；进一步的TUNEL实验证明，液态保存中过量ROS对奶山羊精子凋亡具有诱发作用；精子线粒体膜电位与氧化应激指标检测表明，过量ROS引起精子线粒体氧化应激，导致线粒体结构和功能的损伤。在开展计划任务的同时，课题组还进行其它深入的研究。液态保存中部分精子头部与尾部含有大量双层膜结构的自噬小体；精子自噬关键蛋白LC3、ATG5、p62随液态保存时间延长呈动态表达分布特征；氯喹抑制精子自噬水平可导致精子质量相关参数明显下降；TMT定量蛋白组学技术筛选分析多个自噬相关差异表达蛋白（如：ATG5、MAP1LC3B和PKA）参与调控奶山羊精子自噬过程，提示奶山羊精子自噬是影响液态保存效果的关键机制之一。进一步利用高压快速冷冻电镜观察发现，液态保存中精浆外泌体与精子相互作用关系明显；同时对液态保存中的精浆外泌体进行提取与鉴定，并利用DIO染色验证液态保存中精浆外泌体与精子存在相互作用关系，表明精浆外泌体参与调控奶山羊精子液态保存过程。上述研究结果，从ROS-线粒体途径、精子自噬以及精浆外泌体三个角度，揭示了影响奶山羊精液液态保存效果的关键因素及其细胞分子机理，为保存稀释液配方的研发以及长效保存方法的建立提供理论支撑。