猪精子冷冻保存与凋亡调控因子caspase的关系研究

Caspase是一组在结构上相关的半胱氨酸蛋白酶家族，是细胞凋亡过程中的关键调控因子。在人、马及其它模式动物上发现Caspase家族参与精子凋亡过程，是精子发生过程中的关键调控因子之一。精子在冷冻保存过程中能激活Caspase表达，造成精子大量死亡，但其精确机制不清楚。本项目以猪精液为对象，采用RT-PCR、细胞免疫组化及流式细胞计数等技术和设备检测精子冷冻保存过程中Caspase家族的表达规律；研究精子冷冻保存液中不同成分对Caspase表达的影响。本研究的意义在于明确猪精子在冷冻保存过程中精子死亡的分子机制；阐明精子冷冻保存液成分对精子凋亡关键调控因子Caspase的关系；这对改善猪精液冷冻保存效果，提高冷冻精液人工授精妊娠率及窝产仔数、提高母猪繁殖率及减少种公猪饲养及引进费用等具有重大的科学和实践意义。

猪人工授精技术已经广泛应用于现代养猪生产，但是冷冻精液的使用率仅约1%，与新鲜精液人工授精相比，其受胎率和产仔数偏低10-25%，严重制约了现代养猪产业效率和健康发展。精子抗冻机制研究一直是当前科学研究的重点和难点。精子在冷冻-复苏过程中，精子的细胞结构等受到破坏，激活了细胞凋亡相关的caspase家族基因的表达，引起解冻后精子质量的急剧下降。本项目主要成果如下：（1）猪新鲜精液和低温保存下精子中用常规的PCR检测不到caspase基因表达。（2）直接冷冻猪精子中，细胞凋亡相关的caspase启动、执行和炎症因子caspase-1、-2、-6、-8、-13和-15显著的表达，而关键的细胞凋亡执行因子caspase-3和-7表达量极低。（3）对猪精子中11个内参候选基因的适时荧光定量PCR分析，结合geNORM、NormFinder、Bestkeeper软件，确定ACTB、PGK1、RPL4和GAPDH可以作为猪冷冻保存精子中基因表达分析的最佳参考基因。（4）常用的甘油浓度（3%）与较少使用的2%乙二醇、5%DMSO在抑制猪冷冻保存精子caspase介导的细胞凋亡方面没有显著的差异。3%甘油对细胞凋亡执行因子caspase-6的抑制效果最好。而2%乙二醇在保护精子冷冻过程中细胞膜、线粒体方面更为突出，抑制细胞凋亡启动因子效果更好。综合定量PCR、荧光活性检测、DNA片段化等结果，5%甘油优于3%甘油；0.5%乙二醇抑制凋亡执行因子caspase-6/9效果优于2%乙二醇。（5）三种糖类（海藻糖、蔗糖和乳糖）在抑制猪精子细胞凋亡执行因子caspase-3，6效果方面没有明显差异。因此，在猪精子冷冻保存稀释液中添加不同种类的糖类，能够抑制精子的细胞凋亡，对精子质膜、线粒体等提供有效的保护（6）三种主要的抗氧化剂中，过氧化氢酶在精子冷冻保护方面效果较差。适量的谷胱甘肽GSH（2～3mM）可有效抑制猪精子冷冻过程中细胞凋亡相关的启动因子caspase-2和8。高浓度的SOD能够有效抑制细胞凋亡相关启动因子caspase-2、8和执行因子caspase-6的表达。（7）细胞凋亡执行因子caspase-6在猪精子不同冷冻保存稀释液处理中均大量表达，而caspase-3表达量极低。研究结果将对进一步优化和改善猪精液冷冻稀释液具有重要的科学和实践意义。