基于新鲜组织培养的大肠癌分泌组学研究——从分泌蛋白中寻找新型血清标志物

高灵敏度和高特异性的分子标志物对于大肠癌的早期诊断和有效治疗极为重要。分泌蛋白是肿瘤血清标志物的重要来源。近几年随着蛋白质组学技术的发展，从肿瘤细胞分泌组学中寻找分子标志物逐渐成为的快速发展的新兴研究领域。但是培养细胞与体内肿瘤组织存在较大差异，分泌组学研究的一个重要发展趋势是研究样品要逐渐实现从体外向体内的过渡。在本项目中，我们首次应用新鲜的肠癌组织/远端正常组织的培养液进行研究，在更贴近生理状态的情况下研究肿瘤组织的分泌组学，更利于寻找有效的生物标志物。为了解决新鲜组织培养过程中大量细胞死亡释放出的胞内蛋白污染的瓶颈问题，我们拟利用本实验室已建立的基于凝集素的糖蛋白捕获技术来富集组织培养液中的分泌蛋白，预实验表明该方法大大提高了分泌蛋白的检出数量。在本项目中，我们拟对比30对配对的大肠癌和远端正常组织的分泌蛋白，并对其中5-10种有潜力的差异蛋白在组织、血清中进行生物标志物的筛选和验证

早期诊断对于结直肠癌患者的治疗至关重要。应用新鲜的肠癌组织/正常组织的培养液进行对比研究，可以实现在更贴近生理状态的情况下研究肿瘤组织的分泌组学，更利于寻找有效的生物标志物。在本项目的研究中，我们将凝集素捕获技术用于富集无血清培养液中的分泌蛋白，从而提高分泌蛋白的检出效率。我们收集了9 对配对的早期结直肠癌和远端正常组织的无血清培养液，利用凝集素亲和捕获技术富集了其中的分泌蛋白，进一步利用GeLC-MS/MS技术鉴定了捕获到的蛋白质。通过采用基于肽段谱图计数的非标记定量方法，我们筛查到了123 个在结直肠癌组织和正常组织中显著差异表达的分泌蛋白，其中68 个在癌组织中表达量显著上调。我们对其中的一个蛋白质，EFEMP2，采用多种实验技术（免疫印迹、免疫组化、免疫酶联反应）在组织水平和血清水平进行了详尽的后期验证工作。实验结果显示，EFEMP2 在结直肠癌患者的癌组织和血清中的表达量显著上调，包括结直肠癌早期患者；此外，受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析结果显示，EFEMP2和目前临床上使用的辅助结直肠癌诊断的生物标志物CEA 的ROC 曲线下面积分别为0.923和0.728，说明EFEMP2 用于结直肠癌诊断的准确性显著优于CEA。上述实验结果都说明，EFEMP2 是非常有潜力的结直肠癌早期诊断的血清生物标志物。