OPG/RANKL介导Ghrelin调控动脉钙化的机制研究

Arterial calcification is a positive regulation process resembling bone formation in arterial wall, which can induce serious consequence and threaten the patient's health. The osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is the cytologic mechanism of arterial calicification. Our previous studies demonstrate Ghrelin attenuates osteoblastic differentiation of VSMCs through GHSR-1α/ERK pathway. Meanwhile, Ghrelin regulates the expression of OPG/RANKL in calcifying vascular smooth muscle cells (CVSMCs). To clarify the transcirption mechanism and signaling pathway invovled in Ghrelin regulating OPG/RANKL expression, luciferase reporter assay and cell signaling inhibitor will be used in beta-glycerophosphate induced VSMCs and CVSMCs. To explore whether OPG/RANKL involved in Ghrelin reducing osteoblastic differentiation of VSMCs, shRNA-OPG and adenovirus-Ghrelin will be used. To investigate the effect of Ghrelin on arterial calcifcation in OPG gene knockout mouse, a Ghrelin overexpression will be constructed using adviurs vector. The project devote to reveal the new mechanism of arterial calcification and find the new target for treatment of arterial calcificaiton.

动脉钙化是血管壁发生的一种类似骨形成的主动调节过程，严重危害患者健康。血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨细胞分化是动脉钙化的细胞学基础。我们的前期研究发现Ghrelin可通过GHSR-1α/ERK途径抑制VSMCs向成骨细胞分化，同时Ghrelin调节钙化型血管平滑肌细胞（CVSMCs）的OPG/RANKL表达。本项目探讨Ghrelin调控VSMCs OPG/RANKL表达的转录调节机制和细胞信号转导通路；采用shRNA-OPG和腺病毒-Ghrelin分别低表达和过表达OPG和RANKL，阐明OPG/RANKL在Ghrelin缓解VSMCs向成骨细胞分化的分子机制。通过在动脉钙化动物模型，构建Ghrelin过表达/OPG基因敲除小鼠，观察Ghrelin在体内对动脉钙化的影响及其机制。本项目在原有研究的基础上，揭示动脉钙化新的发病机制，为动脉钙化防治提供新的作用靶点和理论依据。

动脉钙化常见于糖尿病、终末期肾病和老年人，是心血管事件的重要危险因素，可作为糖尿病患者和肾衰患者的心血管事件、脑梗塞和截肢的独立预测因子。Ghrelin是生长激素促分泌素受体(GHSR)的内源性配体，Ghrelin通过其受体GHSR在体内发挥着促进胃肠蠕动、降低血压、调节骨代谢、促进细胞增殖和抑制炎症因子释放等生物学作用。本项目采用首先采用β-甘油磷酸（β-GP）诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化，通过检测采ALP活性和Runx2表达和BMP-2 mRNA，证实β-GP可诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化，是研究动脉钙化的良好的细胞学模型。我们发现随着血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化中RANKL mRNA和蛋白表达逐渐增强。对β-GP诱导的血管平滑肌细胞给予Ghrelin干预，可抑制ALP的活性和RANKL的表达，提示Ghrelin抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。我们进一步发现过表达RANKL阻断了Ghrelin抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的作用。提示RANKL介导了Ghrelin抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞分化的作用。细胞信号机制研究发现Ghrelin通过ERK/AKT途径抑制RANKL的表达。采用细胞信号阻断剂证实Ghrelin通过ERK和PI3K/Akt信号通路抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。同时我们在动脉钙化模型小鼠OPG-/-小鼠中，采用腺病毒载体（Ad-Ghr）和和β-半乳糖苷酶腺病毒对照载体（Ad-Gal）建立Ghrelin过表达小鼠及其对照，采用western blot证实血管Ghrelin过表达构建成功，通过茜素红染色染色和血管壁钙含量测定，发现过表达Ghrelin可抑制动脉钙化的发生。进一步采用免疫组化检测血管壁OC、RANKL、RUNX2的表达，而Ghrelin过表达组的小鼠血管壁OC、RANKL、RUNX2的表达较阴性对照组和空白对照组减少。通过本项目的实施，证实Ghrelin是动脉钙化的防治靶点，为探索动脉钙化的发病机制和防治方法开辟新的思路和新途径。