CFTR相关的miR-15b在精子发生中的作用和miR-15家族在精子发生障碍的诊断应用研究

The purpose of the grant is to confirm the abnormal expression of miR-15b in CFTR knockout mice testis and elucidate the role of miR-15b in spermatogeneis and the related regulatory pathway during the pathophysiological process,including:1) Analysis and confirm the relevance between CFTR and miR-15b and elucidate the mechanistic link of CFTR and miR-15b during the spermatogenesis process.Whether the mutation of CFTR could affect Ago2 protein nuclear/cytoplasm shuttle through Hsp90 protein mediation and whether Ago2 could regulate miR-15b transcription through binding of its promoter.2) Using cell culture model to determine whether miR-15b regulate Cdc25a gene expression through targeting 3'-UTR region; and whether overexpression of miR-15b would reduce Cdc25a gene translation； further clarify whether transgenic overexpression of miR-15b could compromise spermatogenesis and what targets the miR-15b regulate. 3) Detect the expression of miR-15 famliy members in testis, sperm, seminal plasma and plasma to evaluate their expression changes in pathological conditions and further evaluate the possibility of using the expression levels of miR-15 as biomarker to detect spermatogenesis status in male infertility clinic.

本课题围绕本课题组通过miRNA芯片筛选出的在CFTR基因敲除小鼠睾丸组织显著高表达的miR-15b，研究其在精子发生中的作用机制。1）首先研究CFTR在生精细胞对miR-15b 的调节作用。验证CFTR的变异是否通过热休克蛋白Hsp90的介导与Ago2蛋白的浆/核定位有关，并探讨Ago2是否在miR-15b的启动子调节miR-15b的转录过程。2）应用细胞株模型明确miR-15b是否通过对Cdc25a的3-UTR区域的结合调节其表达；miR-15b过量的情况下是否会降低Cdc25a的表达，影响翻译;用在生精细胞高表达miR-15b的转基因小鼠模型观察在过表达miR-15b的情况下，是否会导致精子发生的功能受损并鉴定出调控的靶基因； 3）进一步观察miR-15家族成员在睾丸，精子和精浆，血浆的表达情况，明确其在几类病理情况的表达变化规律，并探讨其用于检测睾丸生精状况的可行性。

囊性跨膜蛋白调节器蛋白（CFTR）突变是白种人中最常见的一种遗传病。累积器官主要包括肺，胰腺和生殖道。既往的研究表明内质网应激和热休克蛋白反应是CFTR突变导致的主要细胞学的改变。为了研究精子发生过程中CFTR的突变对精子发生的影响，我们研究了CF小鼠精子形态发生的相关基因的变化。我们证实了一个在精子细胞特异表达的RNA结合蛋白MSY2的RNA和蛋白水平的变化。同时，我们分别利用定量PCR和Western blot证实在CF小鼠睾丸中具有炎症反应。炎症相关的细胞因子改变。同时这一改变也在细胞水平得到证实。我们的研究首次阐明了睾丸CFTR突变会导致炎症通路的激活和细胞因子的分泌增加。这一结果发表在Plos one上。. 微小RNA最近被证明在精子发生过程中起重要作用, 因为 DROSHA 和 Dicer1 敲除小鼠都表现为雄性不育。然而, 单个miRNA 分子在精子发生过程中的作用仍然。miR-15b, miR-15/16 家庭的一员, 是某些癌症的抑制因子, 主要在睾丸表达。在本课题中, 我们构建了 miR-15b 转基因小鼠模型来研究 miR-15b 在精子发生中的作用。在 miR-15b 转基因小鼠中观察到了受损精子发生, 提示 miR-15b 的适当表达对精子发生至关重要。此外, 我们证明, 表达的 miR-15b 通过靶向 3 '-UTR 区域 CDC25A, 以调节精子发生。体外实验结果进一步表明, CFTR 的突变可能影响 Ago2 与 Dicer1的相互作用, 从而调节了 miR-15b 成熟与表达。我们进一步对无精子症患者的样本研究, 发现男性不育患者在精子和血浆标本中的 miR-15b 表达明显增高, 表明 miR-15b 是 精子发生的潜在标志。我们的研究证明了CFTR通过调节miR-15b的成熟参与了精子发生过程的调节。