DCAF13在卵母细胞发育和母体-胚胎转换过程中的生理功能和分子机制研究

Primordial follicle maintenance, follicle growth, and maternal-zygotic transition processes are key regulated events of female reproduction. These processes are also ideal in vivo model to study epigenetic regulations. The physiological roles of histone H3 trimethylation at lysine 9 (H3K9me3) in regulating balanced gene expression and chromosome configuration changes during oocyte development were insufficiently studied. The recent investigations of our laboratory showed that cullin ring finger ligase-4 (CRL4) complex is crucial for oocyte development. We also identified DCAF13 as a highly conserved novel substrate adaptor protein of CRL4. Our preliminary results suggested that DCAF13 is required for oogenesis from C. elegans to mouse. In mammalian cells, DCAF13 may regulate oocyte genome transcription activity and chromosome configuration changes by mediating the poly-ubiquitination and degradation of SUV39H1/2, the key histone H3 trimethylases. In this study we aim to investigate the functions and regulations of maternal DCAF13 and its substrate SUV391/2 during primordial follicle maintenance, follicle activation and growth, ovulation, and maternal-zygotic transition. We will also elucidate the influence of CRL4-DCAF13 on oocyte transcriptomes and histone methylomes at various developmental stages of oogenesis and early embryo development.

原始卵泡维持、卵泡生长和“母体-胚胎转换”过程，是雌性生殖的关键调控环节，也是研究表观遗传调控的理想模型。目前还不清楚组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）甲基化修饰对卵母细胞各发育阶段基因表达的动态平衡和染色质构象转变有何生理调节意义。申请人近年来发现，CRL4泛素连接酶对卵母细胞发育至关重要，并找到在进化过程中高度保守的、卵子发生所必需的底物识别蛋白DCAF13。初步研究显示，DCAF13可能通过泛素化降解H3K9甲基转移酶SUV39H1/2，调节卵母细胞基因组的转录活性和染色质构象改变，维持雌性生殖功能。本项目以卵母细胞特异性Dcaf13基因敲除小鼠为模型，研究DCAF13及其底物SUV39H1/2在原始卵泡维持和激活、卵泡生长和排卵、受精后母体胚胎转换过程中的生理功能和生化调节机制，并通过微量样本的基因组学研究，阐明CRL4-DCAF13对各时期卵母细胞转录组和组蛋白甲基化组的影响。

所有雌性哺乳动物（包括人类）出生之时，卵母细胞以原始卵泡的形式储存在卵巢中，供一生中所有的生殖活动所需。如果原始卵泡的储备不能维持，或者卵泡不能正常发育，就会造成卵巢早衰、雌性不育。CRL4泛素连接酶复合体介导的生化过程，对于原始卵泡的维持、卵泡生长、卵子成熟和受精卵发育启动，都具有重要生理功能。CRL4通过DCAF家族蛋白作为底物识别亚基，去泛素化修饰多种靶蛋白分子。哺乳动物基因组中有大约90多种基因，负责编码具有DCAF家族结构特征的蛋白。但是目前对这些基因的生理功能研究还很少。本研究首先利用了线虫这种更为简单的模式生物，对所有线虫Dcaf基因进行了RNAi筛选，结果发现一个从前研究很少的基因zk430.7（对应于哺乳动物的Dcaf13基因），是线虫卵子发生所必需的。然后证明DCAF13蛋白确实也在原始卵泡期和生长卵泡期的小鼠卵母细胞中表达，而且发现DCAF13是一个核仁蛋白。研究团队继续制作了卵母细胞特异性的Dcaf13敲除小鼠，并观察到缺失Dcaf13的卵母细胞生长缓慢，很快凋亡，造成卵巢早衰和雌性不育，证明DCAF13是一个从线虫到小鼠都保守的、对于卵子发生至关重要的CRL4底物识别蛋白。DCAF13通过其C末端的SOF1结构域结合核糖体RNA前体，并且和其他重要核糖体蛋白相互作用，参与pre-rRNA的剪切和核糖体小亚基的组装。如果敲除Dcaf13，生长中的卵母细胞就不能积累足够的rRNA和核糖体，从而使细胞中整体蛋白合成水平下降，不能维持正常的卵母细胞功能和染色质构象转换，更不能建立起进一步发育成熟并排卵、受精的潜能。该研究的创新性在于：1）Dcaf13基因虽然在进化上高度保守，从酵母到哺乳动物都存在于基因组中，但这是首次研究其体内生理功能；2）DCAF13是目前发现的唯一一个主要在核仁中定位、并且参与调控rRNA转录后加工的CRL4底物识别蛋白；3）虽然多年前就观察到两栖动物卵母细胞的剧烈生长伴随着rDNA扩增、形成灯刷染色体，并写入多种细胞生物学、发育生物学教科书，但其实这一现象并不存在于哺乳动物中。本研究第一次报道了核仁功能调控蛋白参与维持哺乳动物原始卵泡存活和卵母细胞生长，为卵巢早衰、卵子老化等女性生殖障碍提供了新的潜在机制。