花青素代谢途径的顺反元件和调控模式分析

植物次生代谢产物对环境响应和适应性的形成有重要作用，但目前对调控这类产物的分子机制的了解还不足于对这些关系做深入讨论。在本项目中，我们提出以圆叶牵牛为系统对花中的花青素代谢途径的分子调控机制进行较为全面的模型与实验相互论证的研究，来回答其调控模式的三个机制问题。（1）花瓣中特异调控花青素代谢途径基因的调控因子有哪些识别位点？这些位点在不同目标基因的启动子之间有无差异？（2）调控因子MYB、bHLH和WD如何在启动子空间上构成一个调控单位？是否直接与基部转录因子系统（basal transcription apparatus）互作？（3）MYB、bHLH和WD的复合体对不同的目标基因的调控是否有效率上和模式上的差异？对这些问题的回答允许我们勾勒出组织特异性花青素代谢途径的分子调控机制，并分析它的形成和变异来深入认识MYB-bHLH-WD复合式调控的演变过程。先期试验已证实本项目切实可行。

花青素代谢途径的调控是一个典型的复杂表型的组合调控例子。它涉及三类调控因子-MYB，bHLH和WDR。我们通过对现有技术的充分利用和提升，找到了估算和分析这一调控系统的数量方法(Lu et al. 2012) 。利用生物信息学手段对已有271个不同物种(60)的启动子序列的分析使我们获得疑似顺式调控元件的motifs。在以圆叶牵牛为主的系统中，对这些motifs进行大量的体内和体外序列突变分析结果使我们得以确认对应于MYB1和bHLH2两类调控元件的边界和组成。这些分析利用牵牛的WDR1突变体、双荧光报告基因体系和EMSA分析，具体呈现了改变顺式元件可能带来的后果(Wang et al. 2013)。我们发现组合式调控在牵牛花瓣中可以影响CHS-D、CHI、F3H、F3'H、DFR-B、ANS和bHLH2类基因的表达。对这些基因的5'非编码区的分析显示，它们的顺式元件有较大的差异。其中MYB1的识别元件变化尤其多样，但不同物种的MYB1同源体具有不同的顺式元件识别范围。如果在启动子区加大MYB1和bHLH2两类调控元件的距离，则调控效率会受到影响。酵母双杂结果显示bHLH2与MYB1和WDR1互作，但后两者之间没有显著互作。MYB1可以有强烈的自激活活性，显示它可以和酵母的基部调控系统互作。这些结果已允许我们回答本项目提出的三个科学问题。（1）花瓣中特异调控花青素代谢途径基因的调控因子有哪些识别位点？这些位点在不同目标基因的启动子之间有无差异？结论是MYB1和bHLH2两类调控因子的识别位点在不同基因座上可以有不同的表现形式，但它们具有基本的可识别骨架结构，反映了这类组合式调控久远的进化历史。（2）调控因子MYB、bHLH和WD如何在启动子空间上构成一个调控单位？是否直接与基部转录因子系统（basal transcription apparatus）互作？答案是MYB1和 bHLH2必须与WDR1形成一个调控单元来履行职能， 缺一不可。其中至少MYB1可以与基部调控因子互作，在具体的启动子上它的调控元件位置大多靠近基部调控区域。（3）MYB、bHLH和WD的复合体对不同的目标基因的调控是否有效率上和模式上的差异？我们的结论是MYB1和bHLH2对彼此调控元件的不同距离间隔敏感，其复合体因此存在效率上的差异；不同目标基因通过在5'非编码区上调控元件的数量和分布上的差异