细胞顶底端极性基因罕见变异对人神经管畸形的致病性

Neural tube defects (NTDs) are a group of birth defects with highly genotypic and phenotypic heterogeneity.Their pathogenic genes remain unknown.Epitheliuml cell has polarity in the early embrogenesis,including planner cell polarity (PCP) and apical basal polarity (ABP),which both play a key role in establishing and maintaining cell polarity and is required for normal primary neurulation development. Recently a variety of rare variants in PCP genes have been identifed in human NTDs,confirming mutations of PCP pathway are the genetic basis of human NTDs. Our previous studies have showed that the polymorphisms of ABP gene (PARD3) are related with human NTDs,and copy number variants of ABP genes were identifed in human NTDs. In this project, we will perform high-throughout variant screening of ABP genes in NTD case using next-generation sequencing technology (NGS). The association between rare variants of ABP genes and human NTDs, the genomic burden and spectrum of human NTD-specific rare genetic variant will be analyzed. Furthermore, in vitro overexpression in 293HEK cell and polar cells (MDCK cell) in 3D culture will be applied to study the co-localization, expression and interaction of core ABP/PCP proteins in mutated cell. RNAi lentiviral injection in chick ovo will be applied to explore the developmental phenotyps of chick embryo, the morphology of neurepithelium in ABP gene knocked-down chick embryo model.

神经管畸形是一组基因型和表型高度异质性的出生缺陷，致病基因不明。胚胎发育早期的神经上皮细胞具有极性，包括细胞平面极性(PCP)和顶底端极性(ABP)，这些细胞极性正常形成和维持是初级神经胚发育的基础。近来研究人员在人NTDs患者发现各种PCP基因罕见变异，证实PCP基因突变是人NTDs的遗传基础；我们前期研究发现ABP基因（PARD3）多态性和人NTDs相关，且在人NTD患者中发现ABP基因拷贝数变异。本项目利用二代测序技术对人NTDs患者开展ABP通路基因的高通量筛查，分析ABP基因罕见变异与人NTDs的相关性，获得人NTDs特异性ABP基因罕见变异的负荷量、变异图谱；利用293HEK细胞、极性细胞3D培养下体外过表达体系分析ABP基因变异细胞内核心ABP、PCP蛋白表达以及共定位和相互作用；利用慢病毒RNAi技术i建立ABP基因沉默鸡胚模型，分析ABP基因沉默后鸡胚发育表型、神经上皮形态学。

神经管畸形是一组基因型和表型高度异质性的出生缺陷，致病基因不明。胚胎发育早期的神经上皮细胞具有极性，包括细胞平面极性(PCP)和顶底端极性(ABP),这些细胞极性正常形成和维持是初级神经胚发育的基础。近来研究人员在人NTDs 患者发现各种PCP 基因罕见变异，证实PCP 基因突变是人NTDs 的遗传基础，但ABP通路基因变异与NTD关系尚不明确。.本研究采用全基因组芯片结合二代测序技术对颅部NTDs和对照组胎儿组织开展ABP通路核心分子测序，分析PARD3基因罕见变异与人颅部NTDs 的相关性，获得人颅部NTDs特异性基因变异的负荷量、变异位置图谱；结合常规分子生物学技术，并利用293HEK 细胞/极性细胞体外过表达系统研究PARD3基因变异后PARD3/aPKC蛋白表达、共定位和相互作用；利用RNAi技术建立神经干细胞、鸡胚的PARD3 敲减模型，分析PARD3基因沉默后鸡胚发育表型、神经上皮形态学；利用MDCK极性细胞3D培养模型结合体外过表达系统、RNAi基因敲减技术分析ABP和PCP核心分子（PARD3和VANGL2）在极性细胞中的定位和调控、及其相互作用在神经官腔发育中的作用。..研究结果显示ABP核心基因-PARD3基因，尤其是aPKC结合域的PARD3基因罕见变异在人颅NTDs发生危险，此类变异改变了PARD3-aPKC结合力、自身磷酸化和细胞紧密形成，发挥功能丧失效果。而PARD3基因敲减后导致神经干细胞出现极性紊乱，神经轴突异常；鸡胚出现明显短尾现象，神经上皮细胞极性发育进程明显异常。这些研究结果阐述了PARD3基因变异导致神经管发育异常的内在机理，在国际上首次澄清了ABP通路在神经管发育畸形中和PCP通路具有类似作用，对神经管畸形发生的遗传背景有了新的认识。..同时发现ABP和PCP通路核心蛋白-Par3和Vangl2在哺乳动物上皮细胞极性发生过程存在细胞膜顶端共定位，且在细胞内形成生理复合物。利用Par3和Vangl2敲减模型发现Par3敲减后导致Vangl2蛋白细胞膜顶端部位分布减少，细胞黏附连接和管腔化异常，反之则无。此结果对后期进一步深入研究ABP和PCP通路核心蛋白在神经管官腔发育中的定位、联合作用和调控提供基础，也为今后整合研究不同极性通路基因变异与神经管畸形发生的关系提供依据。