牙胚发育早期BMP/MAPK和Wnt/β-catenin信号通路在牙上皮命运决定和细胞增殖中的作用及其机制研究

The determination of dental epithelial fate and cell proliferation is very critical for early tooth development. Multiple BMP and Wnt signaling molecules are expressed and play important roles in early dental epithelium. Noggin is well recognized as an antagonist of BMP signaling pathway. However, our preliminary study suggests that overexpressed Noggin in the dental epithelium might inhibit Wnt/β-catenin signaling pathway besides BMP/MAPK pathway. In addition, Wnt/β-catenin pathway might be involved in determination of the dental epithelial fate, and synergistically control dental epithelial cell proliferation with BMP/MAPK pathway. Based on our preliminary data, the following scientific questions will be answered using a variety of transgenic mouse lines and molecular biological methods: (1) Whether Noggin is able to antagonize Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo, and its underlying molecular mechanisms; (2) Whether the dental epithelial fate in early development is determined and maintained by Wnt/β-catenin pathway but not BMP/MAPK pathway; (3) Whether the cell proliferation rate of dental epithelium during early development is synergistically affected by BMP/MAPK and Wnt/β-catenin pathways; (4) Whether BMP/MAPK and Wnt/β-catenin pathways interact reciprocally in the early dental epithelium.

细胞命运决定和增殖贯穿了牙胚发育的整个过程，BMP和Wnt信号分子参与了牙胚发育，Noggin被公认为是BMP信号通路的特异性拮抗剂。本课题组前期研究提示：在早期牙上皮内过表达Noggin，除抑制BMP/MAPK外，还可能抑制Wnt/β-catenin；Wnt/β-catenin可能决定牙上皮命运，并可能协同BMP/MAPK调控上皮增殖。基于前期研究基础，本课题拟使用多种转基因小鼠模型和分子生物学手段解决以下关键科学问题：⑴ 在体外和体内研究Noggin是否可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，并阐述其分子机制；⑵ 在牙胚发育早期牙上皮命运是否由Wnt/β-catenin信号决定并维持，而不受BMP/MAPK信号影响；⑶ 在牙胚发育早期上皮增殖是否由BMP/MAPK和Wnt/β-catenin协同影响；⑷ 在牙胚发育早期上皮内BMP/MAPK和Wnt/β-catenin是否互相调控。

本课题组前期研究发现K14Cre;pNog小鼠牙上皮内过表达BMP信号通路拮抗剂Noggin后，牙齿发育停滞于牙板期，牙齿表型较单独敲除BMP信号通路严重。进一步研究发现在牙胚上皮中过表达的Noggin抑制了BMP/MAPK信号通路，且发现K14Cre;pNog小鼠牙上皮中Wnt/β-catenin 信号通路活性降低。基于前期研究基础，本课题采用多种小鼠模型和多种分子生物学手段解决了在申请书中提出的四个关键科学问题，发现：⑴体外和体内实验均进一步证实Noggin在牙上皮抑制了Wnt/β-catenin 信号通路的活性，进一步研究发现Noggin通过直接与Wnts蛋白结合来实现对Wnt/β-catenin信号通路活性的抑制作用，分子生物学实验发现Noggin通过其CRD（富半胱氨酸区）与Wnts蛋白结合，虽Noggin与Wnts和BMPs蛋白结合的结构域不同，但BMPs和Wnts可竞争性结合Noggin；⑵ 挽救实验证实在牙胚发育早期BMP/MAPK信号通路不能决定牙上皮命运，牙上皮命运由Wnt/β-catenin信号通路决定，且Pitx2是介导Wnt/β-catenin信号通路对牙上皮命运决定的关键因子；⑶ 牙胚发育早期上皮增殖是由BMP/MAPK 和Wnt/β-catenin 信号通路协同调控，但BMP/MAPK信号通路调控牙胚上皮细胞增殖的作用较Wnt/β-catenin信号通路强；⑷ 在牙胚发育早期上皮内BMP/MAPK不参与对Wnt/β-catenin信号通路的调控，排除了在K14Cre; pNog小鼠中发生的Wnt/β-catenin信号通路活性改变是由Noggin通过BMP/MAPK间接调控的可能性。总之，本研究发现Noggin作为分泌蛋白，可以在牙上皮内同时结合BMPs和Wnts蛋白，分别抑制牙上皮内BMP/MAPK和Wnt/β-catenin 信号通路活性，前者主要起调控牙上皮细胞增殖的作用，后者通过Pitx2决定牙上皮命运，同时参与调控牙上皮细胞增殖。另外，围绕本研究涉及的BMP和Wnt信号通路新增了两者在腭板发育和牙间充质细胞增殖及分化中的作用及上游调控机制的研究，为后续研究奠定基础。