牙胚发育早期BMP-MAPK和BMP-Smad1/5信号通路分别在上皮和间充质内不同功能及其调控机制的研究

BMP plays important roles during early tooth development.BMP signals are mainly conducted through cononical signaling pathway (BMP-Smad1/5/8/Smad4) and non-cononical signaling pathway(BMP-MAPK).Preliminary studies of our group have demonstrated that non-cononical BMP signaling pathway is involved in dental epithelium development; Phospho-Smad1/5 is wildly expressed in dental mesenchyme, mediating BMP regulation of Msx1 expression, and also maintains mesenchymal fate;however, P-Smad1/5 is unable to activate BRE transcription and is not involved in the cononical BMP signaling pathwy.Based on these previous findings,the purpose of this project is to resolve the following scientific questions:How non-cononical BMP signaling pathway regulates the development of epithelium, and its molecular mechanism;what's the biological function of P-Smad1/5 expressed in dental mesenchyme, and the mechanism of regulation of Msx1; Why P-Smad1/5 not involved in the cononical BMP signaling pathway.This project will further improve the molecular mechanism of BMP functions in early tooth development.

BMP是牙胚早期发育过程中重要的信号分子, BMP主要通过经典信号通路（BMP-Smad1/5/8/Smad4）和非经典信号通路（BMP-MAPK）传导。本课题组前期研究发现：在牙胚发育早期BMP非经典通路参与上皮发育；P-Smad1/5在间充质内广泛表达，介导BMP调控Mxs1，维持间充质命运；但间充质内广泛表达的P-Smad1/5不能激活BRE，未参与BMP经典信号通路。基于以上发现本课题主要解决以下科学问题：BMP非经典信号如何调控上皮发育及其具体机制；间充质内的P-Smad1/5的生物学功能以及调控Msx1的具体分子机制；间充质内的P-Smad1/5为何不参与BMP经典信号通路，参与了何信号通路。通过本项目的研究将进一步完善BMP信号调控牙胚早期发育的机制。

BMP信号在牙胚发育过程中发挥重要作用，主要通过Smad依赖型的经典信号通路和非经典信号通路即MAPK传导。为研究BMP信号在牙胚上皮中的功能，本课题使用了可以在牙胚上皮中过表达BMP拮抗剂Noggin的转基因小鼠K14Cre;pNog。此小鼠牙胚发育停滞在蕾状期，上皮增殖能力减弱，决定上皮命运的分子Pitx2表达消失。利用此小鼠发现在上皮中过表达Noggin后抑制了BMP非经典信号通路，而不影响BMP经典信号通路。在体外培养的牙胚实验中，抑制非经典信号通路后仅抑制上皮增殖，而不影响上皮内Pitx2的表达。利用Wnt信号通路报告基因小鼠BAT-Gal，发现Noggin可抑制Wnt/β-Catenin信号通路，从而导致上皮内Pitx2表达消失。蛋白免疫沉淀、原位PLA、Top-flash检测发现Noggin可以直接和Wnt配体结合，抑制Wnt信号通路。使用多种转基因小鼠或基因敲除小鼠进行挽救实验，发现BMP和Wnt协同调控牙胚上皮增殖，而Wnt信号单独决定牙胚上皮命运。本部分研究揭示了BMP非经典信号通路和Wnt/β-Catenin信号通路协同调控牙胚上皮发育的分子机制。Smad4是BMP经典信号通路的核心分子，BMP-Smad1/5信号参与牙胚间充质发育并调控间充质内Msx1的表达，但在牙胚间充质内敲除Smad4后不影响牙胚发育。因此本课题进一步研究了在牙胚间充质内BMP调控Msx1过程中RSmad和Samd4的作用机制。使用BRE-Gal小鼠发现在牙胚间充质内BMP经典信号通路未激活，同时使用蛋白免疫沉淀和原位PLA在牙胚间充质内未检测到pSmad1/5-Smad4复合体。在牙胚间充质内过表达Smad4或抑制Smad2/3后可形成pSmad1/5-Smad4复合体，激活BMP经典信号通路，说明BMP经典信号通路在间充质内未激活是因为Smad2/3和Smad4具有高亲和性，竞争性抑制了Smad4和pSmad1/5结合。进一步使用siRNA发现在牙胚间充质内BMP诱导Msx1表达仅依赖于Smad1/5而不依赖于Smad4。使用敲除Smad4的牙胚间充质细胞发现敲除Smad4后BMP激活的Smad1/5仍可以由胞浆进入胞核，并可结合于Msx1基因启动子，调控Msx1基因表达。本部分研究在牙胚间充质内发现了一条新的信号通路，即非典型的BMP经典信号通路.