哺乳动物中PPR蛋白的系统研究

Pentatricopeptide repeat （PPR）protein is a kind of non-classical RNA-binding protein containing a canonical 35 residue repeat motif. It plays important roles in transcription, processing, stability, editing and translation. Though its functions are divers, there are only 7 PPR proteins in mammals and all of them are predominantly localized into mitochondria, including mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), mitochondrial RNase P component MRPP3, Leucine-rich PPR cassette (LRPPRC), 3 pentatricopeptide domain (PTCD) contained protein PTCD1-3 and mitochondrial ribosomal protein MRPS27, Among these proteins only POLRMT has been extensively studied, the mechanism and biological function of the rest proteins remain elusive..We thus propose to focus on studying these PPR protein: systematically study the regulatory role of PPR protein in mitochondrial gene expression at series stages, resolve structure of PPR protein by X-ray crystallography, and analyze the bridge role of PPR protein in cotranscriptional processing and translation. Through a series of proposed experiments, we aim to uncover the biological role of PPR protein in mitochondrial gene expression and function.

PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白是一类广泛存在于真核生物体中含有35个氨基酸的简单重复基序的RNA结合蛋白，这类蛋白主要参与基因的转录、转录后加工、RNA稳定性、RNA编辑及翻译过程。在哺乳动物中，已发现的7个PPR蛋白都存在于线粒体中，包括线粒体RNA聚合酶（POLRMT）、RNase P蛋白组分MRPP3、LRPPRC、PTCD1-3及MRPS27，其中除了线粒体RNA聚合酶负责线粒体基因的转录之外，对其他的PPR蛋白了解很少。本申请项目将系统研究PPR蛋白在线粒体基因表达中的作用机制：通过分析PPR蛋白在线粒体基因表达不同阶段的作用，解析PPR蛋白的结构及其对RNA识别的序列特异性，分析PPR蛋白在线粒体DNA转录、加工及翻译中的桥梁作用。本申请项目通过一系列既定的实验方案将揭示PPR蛋白在线粒体基因表达中的作用机理。

PPR蛋白是一类广泛存在于真核生物体中含有35个氨基酸的简单重复基序的RNA结合蛋白，这类蛋白主要参与基因的转录、转录后加工、RNA稳定性、RNA编辑及翻译过程，其突变会影响线粒体基因表达以及呼吸链复合体的功能。.早期在线虫中发现了 RNA 干扰现象的存在，随后发现从酵母到哺乳动物中都存 在这一现象。作为基因沉默的方式之一，RNA 干扰主要用于防御病毒 RNA 的侵染以 及抵制转座子的移动，也参与染色质与 DNA 修饰，这些应用主要集中于细胞质以及 细胞核中。根据内共生假说，线粒体起源于原核生物，长期被认为没有 RNA 干扰现 象存在。但有报道发现线粒体中存在特异的 microRNA 以及 Ago2 蛋白。miRNA 与 siRNA 大小相似，都需要 Ago2 介导发挥功能， 这对我们后续实验有极大的借鉴意义。.通过 ClickIn 的方法，证明了 siRNA可以进入线粒体基质；而且发现siRNA特异性切割线粒体转录产物，可以在 RNA 水平上敲低线粒体编码的 13 个基因。在常规的敲低实验时间窗又中，mitoRNAi 对线粒体编码的相对不稳定的复合体 IV 亚基 COXI，COXII，以及 COXIII 有显著的敲低效果，而对相对稳定的亚基诸如 ND1 则需要增加处理的时间窗或破坏其所在的复合体的稳定性才能达到显著的效果。同样，mitoRNAi 发挥 作用需要 Ago2 蛋白。前期工作于2020年发表于Cell Research杂志。.应用 mitoRNAi 技术，我们进一步研究了线粒体编码的亚基在复合体 IV 的生成以及组装中的功能，进而来阐述PPR蛋白突变对线粒体呼吸链复合体功能的影响的分子基础。这部分工作正在撰写投稿中。