基于微流控芯片技术的饮用水快速隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测

Cryptosporidium and Giardia are the two most common intestinal parasites in the world. They can spread through the drinking water and food contamination, and the outbreaks were frequently reported. The WHO has listed them as among most common 10 parasite diseases and among 6 most common diarrheal diseases. In 2006, China government has added the measurement of Cryptosporidium and Giardia into Sanitary standard for drinking water (GB/T 5750-2006). The present analysis procedure includes filtration, centrifugation, immunomagnetic separation (IMS) and fluorescence detection. The whole process is complicated, expensive, requiring of modern instruments and manual intervention. Herein we propose a microfluidic assay for rapid detection of Cryptosporidium Oocysts and Giardia Cysts in drinking water. The core components of the assay are the microfluidic chips which are capable of rapid capture and enrichment of the Cryptosporidium Oocysts and Giardia Cysts and following immunoanalysis and nucleotide analysis. Based on the microfluidic chips, the prototype instruments will be developed to fulfill the need of techniques for rapid Cryptosporidium and Giardia analysis in drinking water.

隐孢子虫和贾第鞭毛虫（简称"两虫"）是世界范围内十分常见的感染人类、宠物或野生动物的肠道原虫，可以呈集体性暴发流行，主要是由于饮用水源的污染或食物的污染而引发。世界卫生组织（WHO）将其列入世界最常见的十大寄生虫病和世界最常见六大腹泻病。2006年中国卫生部将隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测写入《生活饮用水卫生标准》GB/T 5750-2006中，主要检测步骤：过滤取样、淘洗、离心、免疫磁分离及免疫荧光检测隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊。该技术复杂，设备和检测试剂费用昂贵，自动化程度很低。现在我们计划结合微流控芯片技术、芯片病原微生物富集技术和最新的免疫分析技术和核酸分析技术，设计制造对水中两虫卵囊/孢囊进行快速和高灵敏度免疫分析和核酸分析的微流控芯片，并且以此微流控芯片为核心设计制作能对两虫卵囊/孢囊进行快速分析的仪器平台系统。解决目前饮用水、水源中两虫卵囊/孢囊快速检测分析技术缺乏的问题。

隐孢子虫和贾第鞭毛虫（两虫）是常见的感染人类的肠道原虫，2006 年中国卫生部将隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测写入《生活饮用水卫生标准》GB/T5750-2006 中，主要检测步骤包括：过滤取样、淘洗、离心、免疫磁分离及免疫荧光检测隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊，技术复杂，设备和检测试剂昂贵，自动化程度很低。本项目整合了微流控芯片技术、芯片微生物富集技术和最新的免疫分析技术和核酸分析技术，设计制造对水中两虫卵囊/孢囊进行快速和高灵敏度免疫分析和核酸分析的微流控芯片，并且以此微流控芯片为核心设计制作了对两虫卵囊/孢囊进行快速分析的仪器平台系统。.项目获得了以下成果（1）研发了卵囊/孢囊的快速捕获技术，设计的滤芯式微流控芯片可对1微米直径的细小颗粒进行100%高效拦截，实现隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的快速捕获。（2）设计制作了基于免疫荧光技术的快速检测两虫卵囊/孢囊的芯片，采用微滤芯片结合免疫荧光技术对卵囊包囊进行原位荧光检测，在芯片内直接完成卵（包）囊拦截富集，免疫荧光抗体孵育，和原位观察，避免了传统方法富集与检测分离造成的样本损失，检测准确率在87 %以上。（3）开发了隐孢子虫和贾第鞭毛虫的等温核酸扩增检测技术，针对特征基因序列筛选引物，最终选择Cp-18S-148系列引物与Cp-EF1α-54系列引物检测隐孢子虫，选择Gl-EF1α-ref1与Gl-18S-4系列引物检测贾第鞭毛虫。开发的等温核酸扩增体系具有良好的选择性和灵敏性，对两虫目标基因的检测限均可达到20拷贝。 同时开发了配套检测试剂，包含引物、Bst酶和缓冲液，并实现了试剂凝胶预置和冻干预置。（4）开发了多种高通量核酸扩增检测芯片和配套仪器。设计了20通量恒温检测微流控芯片，可同时对9样本中的两虫的核酸进行检测。开发的样机平台整合了光学、温控、机械传动、控制系统等，检测时间少于40分钟。项目可以解决目前饮用水两虫卵囊/孢囊快速检测技术缺乏的问题，而且采用芯片技术降低试剂的消耗，提高自动化，可以极大的降低成本，具有很好的产业化前景，在技术层面上圆满完成项目要求。.项目的执行过程中，共发表论文12篇，其中包括Analytical Chemistry 2 篇。申请专利4项，包括3项发明专利和实用新型专利1项，其中获得授权1项。培养博士后2人，博士生2人，硕士3人。总体上超额完成了项目的全部考核指标。