长牡蛎C-型凝集素调控炎症因子表达的机制研究

C-type lectins as an important kind of pattern recognition receptors play crucial roles in immune recognition and immune signal transduction. The studies about C-type lectins mainly focus on the functions of recognition, agglutination, phagocytosis and clearance of pathogens. Almost no reports about the mechanism of C-type lectins in invertebrates in regulating inflammatory cytokines till now. This research aims to study the mechanism of a transmembrane C-type lectin (HTM-CTL) with higher expression in oyster Crassostrea gigas hemocytes in regulating the interleukin (IL) production. The RNA interference, mRNA over-expression assays are used to detect if C. gigas HTM-CTL can regulate the downstream gene activations of spleen tyrosine kinase, extracellular regulated protein kinases, glycogen synthase kinase 3β, nuclear factor-κB (NF-κB) and NF-κB nuclear translocation, IL production to analyze the regulatory mechanism of HTM-CTL for ILs. And, the mechanism of interaction of HTM-CTL with other protein by Pull down and co-immunoprecipitation assays, clarification of related inflammatory signaling pathway activation after HTM-CTL binding to pathogens and the effectors regulated by the signaling pathway. These studies will enrich the theory of invertebrate immunity and are helpful to develop new strategies for disease control in mollusc aquaculture.

C-型凝集素是一类重要的模式识别受体，在固有免疫的免疫识别和免疫信号转导中发挥关键作用。目前无脊椎动物C-型凝集素相关研究主要集中在识别、凝集、吞噬和清除病原微生物等方面，在其调控炎症因子机制方面鲜有报道。本项目选取在长牡蛎血细胞中高表达的跨膜型C-型凝集素(HTM-CTL)，运用RNA干扰、mRNA过表达等技术敲降或增加其表达后，检测下游基因脾酪氨酸激酶、胞外信号调节蛋白激酶、糖原合成酶激酶3β、核因子NF-κB的活性及NF-κB的核移位、炎症因子ILs的含量，解析HTM-CTL对ILs的调控作用。同时利用Pull down、免疫共沉淀等手段确定与HTM-CTL直接结合的蛋白及其作用机制，阐明HTM-CTL与病原菌结合后所激活的炎症相关的信号通路及调控ILs的分子机制，丰富和发展无脊椎动物固有免疫理论，为贝类养殖产业的病害防治提供新思路。

炎症是机体对于免疫刺激的一种防御反应，一直是免疫学研究的重点内容。近年来，包括白介素（ILs）、肿瘤坏死因子（TNFs）、高迁移率族蛋白B（HMGB1）和类干扰素（IFNLP）在内的多种细胞因子相继在无脊椎动物中被发现，它们在抵御外来病原菌入侵中发挥重要作用，提示炎症也是无脊椎动物重要的免疫防御机制。本项目从长牡蛎中鉴定出一种类似高等动物凝集素Dectin-1的膜受体CgCLec-HTM和一个类Dectin-2的膜受体CgCLec-TM1。这两个分子均能通过其糖识别结构域（CRD）识别多种细菌和多糖，之后CgCLec-HTM通过其胞内的非经典的ITAM（hemITAM）募集胞内脾酪氨酸激酶（CgSyk）促进细胞外信号调节激酶（CgERK）的磷酸化。活化的CgERK直接与CgRel相互作用，促进CgRel的转位入核，进而诱导CgIL17s和CgTNF的产生。CgCLec-TM1 能够通过其CRD结合大肠杆菌和灿烂弧菌，然后通过诱导CgERK的磷酸化。活化的 CgERK 与CgGSK3β相互作用，使其Ser9位点发生磷酸化，最终诱导CgIL17-1和 CgIL17-5的mRNA的表达。在高等动物中，Dectin-1和Dectin-2主要是识别真菌表面的β-葡聚糖，而长牡蛎CgCLec-HTM和CgCLec-TM1可以识别细菌和多糖，此外发现活化的CgERK直接与CgRel和CgGSK3β相互作用。该成果为进一步研究低等无脊椎动物炎症发生机理提供了重要参考。此外在长牡蛎中克隆鉴定了CgFLP1、CgBCL10和CgAP-1，发现CgFLP1可以与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶（CgMASPL-1）的CUB结构域相互作用，参与激活补体凝集素途径，CgBCL10和CgAP-1可以介导病原诱导的炎症因子的表达。本项目成果在The Journal of Immunology（2篇），Fish and Shellfish Immunology（3篇）等杂志发表论文5篇，其中一篇被The Journal of Immunology编辑遴选为“TOP READS”。