microRNA-495在肿瘤辐射中的增敏机制研究

The radiation resistance of tumor cells need to be overcome during the radiation therapy for carcinoma patients. Therefore, elucidating the factors that affect the tumor radiosensitivity has important scientific and clinical significance.Significance of microRNA radiation on the regulation of tumor is becoming increasingly prominent.Four-and-a-half LIM1 （FHL1） is a new type of radiation-induced genes. Our previous study showed that miR-495 could regulate tumor growth by downregulated FHL1. Therefore, we intend to further investigate the role of FHL1-targeting miR-495 in the regulation of tumor radiosensitivity and its potential mechanism. In breast cancer cells, firstly, the effect of ionizing radiati on on the miR-495 expression will be clarified. In addition, the relationship between miR-495 and tumor radiosensitivity will be examined by overexpression of miR-495 (gain-of-function) or specific silencing of miR-495 (loss-of-function). Last but not the least, the molecular mechanism of miR-495 in the ioniz ing radiation will be elucidated, which could provide abundant evidence for the ef fect and mechinism of miRNAs in ionizing radiation,and would provide better means of intervention for cancer radiotherapy.

肿瘤细胞的辐射抵抗性是目前采用放疗方法治疗肿瘤需要克服的问题，挖掘增强肿瘤辐射敏感性的手段具有重要的科学和临床意义。microRNA对肿瘤辐射敏感性调节的重要意义日益凸显。本课题组前期证明Four-and-a-half LIM1（FHL1）是重要的新型辐射诱导基因，并且miR-495能靶向作用于FHL1 3'端非翻译区，通过调节FHL1基因表达继而调节肿瘤细胞功能。申请人拟针对miR-495在辐射调控中的增敏作用及其机制进行深入研究。选取乳腺癌细胞模型，利用逆转录-荧光定量PCR等技术研究电离辐射对miR-495表达的影响；采用分子生物学手段确定靶向FHL1的miR-495与肿瘤细胞辐射敏感性的关系；更深入阐明miR-495在电离辐射中发挥功能的分子机理，为更好地阐明和丰富 miRNAs 在辐射调控中的作用及机理研究，并为解决肿瘤放疗和辐射基因治疗提供新的理论依据和干预手段。

放疗是临床经典抗肿瘤治疗手段之一，但仍存在如下问题：1）一些肿瘤对射线敏感性不高，因为癌变中已频繁经历过染色体双链DNA断裂等严重基因组不稳定性损伤的肿瘤细胞已获得了对电离辐射损伤的耐受性，导致疗效下降。2）肿瘤细胞在经过离子辐射后，会出现细胞周期阻滞，对损伤的DNA进行修复，避免出现致死性损伤，从而增强细胞的放射抵抗性；3）辐射损伤的旁效应存在对未辐射器官的损伤作用。因此，需要提高肿瘤细胞对放疗的敏感性、减低辐射旁效应，使肿瘤放疗方案变得更加合理化、有效化和个体化。已有报道表明，非编码微小RNA(miRNA)通过选择调节肿瘤放射细胞信号转导通路基因，对揭示辐射的分子生物学机制及潜在的放疗等肿瘤治疗手段的临床应用价值具有重要意义。本研究围绕调控辐射诱导基因FHL1的miRNA入手，研究其参与调节电离辐射的机制和潜在应用。. 本研究表明，HepG2、ZR75-1、Hela辐射后内源miR-495的表达水平较辐射前降低。利用miR-495过表达ZR75-1稳定细胞系经不同剂量照射后通过细胞集落形成情况绘制存活曲线，miR-495可以显著增强肿瘤细胞的辐射敏感性，且该作用为FHL1依赖性。在乳腺癌细胞系中构建miR-495过表达和对照细胞系，辐射后miR495可以降低SP1、iNOS、eNOS mRNA和蛋白表达水平。生物信息学分析预测结合荧光素酶转录活性实验证明，miRNA495可以直接靶向Sp1，Sp1继而通过调控eNOS启动子区域调控eNOS表达。流式和ELISA实验表明miRNA495过表达，在辐射的条件下降低NO及其表达产物TGF-β。而NO和TGF-β是辐射旁效应的重要介质。体外培养基转移实验表明，经过miRNA495过表达的细胞的上清孵育正常肝细胞，与对照组相比，可以减少微核的形成。体内荷瘤动物局部放疗实验表明，过表达miR-495不仅可以使得肿瘤对辐射增敏，还可以保护肝脏免受辐射旁效应的损伤，对照组和非相关miRNA组，肝脏坏死灶增多，而miRNA495过表达组的肝脏趋于正常。. 本研究已经对于miRNA495的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及用途已经申请专利，相信经过后续成果转化和miRNA成药性研发，完全有可能将该策略用于临床肿瘤的放疗应用。