原儿茶酸在帕金森病中的神经保护作用及对PHOX-ROS和TLR4信号通路的调控机制研究

帕金森病（PD）发病率逐年升高，而治疗药物如L-多巴等不能从根本上治疗该病且副作用较高，开发高效低毒的药物迫在眉睫。本课题组发现中药益智仁中原儿茶酸（PCA）能抑制H2O2、MPP+诱导的PC12细胞凋亡，抑制脂多糖（LPS）引起的小胶质细胞活化及炎症因子的产生，提高老年鼠的认知和脑组织抗氧化能力，并且该药物无明显的毒副作用，有望在PD中应用。因此本项目拟采用MPTP诱导的小鼠PD模型明确PCA对PD的预防和治疗作用；并利用中脑多巴胺神经元、神经元-胶质混合细胞和纯小胶质细胞体系，采用MPP+ /LPS诱导损伤，从抗炎和抗氧化角度研究PCA对PHOX-ROS和TLR4信号通路的调节作用，进而明确PCA的保护作用机制和治疗靶点。本研究不仅对于阐明小胶质细胞介导的炎症反应和氧化损伤在多巴胺神经元退化变性中的作用具有重要意义，而且从机制方面为PCA的新药开发提供理论依据。

原儿茶酸（PCA）是一种酚酸类化合物，具有抑菌抗炎和清除自由基活性。而帕金森（PD）患者脑内炎症以及氧化应激反应提示抗炎药物和抗氧化剂有可能成为治疗PD的药物。本项目重点研究PCA在帕金森病中的作用及对PHOX-ROS和TLR4信号通路的调控作用。.利用神经毒素MPTP诱导小鼠PD模型，从行为学考察PCA对PD小鼠运动、探究和附着能力的影响。免疫组化和western blot实验观测PCA对PD小鼠中脑和纹状体酪氨酸羟化酶（TH）表达、细胞凋亡以及MAPK信号通路的影响。实验结果表明PCA能促进PD模型小鼠的自发运动和探究能力，改善运动功能。PCA显著提高了TH表达量，抑制脑中小胶质细胞活化，减少神经细胞凋亡。进一步研究发现PCA可通过提高Bcl-2/Bax比值，降低凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8表达量，阻止P38信号通路的激活抑制细胞凋亡, 从而发挥预防和治疗帕金森病的作用。.利用多巴胺神经元和星形胶质细胞培养体系，采用MPP+诱导损伤，免疫荧光、western blot、ELISA等研究PCA对神经细胞的保护作用。细胞免疫染色及细胞计数结果发现PCA能有效抑制MPP+介导的神经元和胶质细胞损伤。细胞活力分析和乳酸脱氢酶（LDH）检测证明了原儿茶酸可抑制MPP+引起的细胞活力下降和LDH漏出从而保护质膜的完整性。此外，原儿茶酸能抑制自由基的生成，线粒体膜电位的丧失及星形胶质细胞的凋亡。这些结果表明原儿茶酸可能是通过调节线粒体的通透性而抑制氧化应激所致的多巴胺能神经元和胶质细胞损伤。.利用多巴胺神经元-胶质细胞混合培养、去除小胶质细胞和纯小胶质细胞培养体系证实了脂多糖激活小胶质细胞对多巴胺能神经元造成损伤。PCA通过抑制小胶质细胞TLR4/NF-κB信号通路的激活，进而抑制下游炎症因子TNF-α和神经毒素NO的产生，减少其对多巴胺神经元的损害，证实了小胶质细胞是该药物作用的靶细胞。此外发现PCA通过抑制小胶质细胞NADPH氧化酶gp91基因的表达，减少细胞外超氧离子和ROS的产生， 抑制PHOX-ROS信号通路，减轻其对多巴胺神经元的损害。.本研究对于阐明小胶质细胞介导的炎症反应和氧化损伤在多巴胺神经元退化变性中具有重要意义，而且从机制方面为PCA的新药开发提供了理论依据。