减毒迟缓爱德华氏菌作为疫苗载体呈递异源抗原的研究

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是水产养殖动物的重要病原，减毒E.tarda疫苗已用于爱德华氏菌病的预防。以减毒活疫苗作为表达和呈递异源抗原的载体研制多价活疫苗，成为疫苗领域的一个新方向。利用细菌的蛋白分泌系统呈递异源抗原是构建疫苗载体的有效途径。本项目拟开展以E.tarda的III型分泌系统(T3SS)为抗原呈递途径，建立减毒E.tarda多价活疫苗载体的研究，通过综合运用融合蛋白表达载体构建、基因突变、细胞培养、Western blot、免疫组化等技术方法，在鉴定T3SS效应蛋白转运信号肽的基础上，建立以营养基因asd(天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶）为筛选标记的减毒E.tarda活疫苗载体；在确定疫苗载体呈递异源抗原和刺激宿主免疫应答的基础上，建立减毒E.tarda二价载体活疫苗，研究活疫苗的免疫应答和免疫保护。本研究将为研发水产养殖的新型疫苗提供有用的资料。

本项目开展了以减毒迟缓爱德华氏菌为疫苗载体呈递异源抗原的研究。通过生物信息学分析编码E. tarda三型分泌系统效应蛋白EseG和ORF29的分泌信号肽区域，将这些区域亚克隆至表达质粒pCX341，以β-内酰胺酶（TEM-1）为报告基因鉴定了EseG 的四个区域和ORF29N端的1个区域能介导报告基因的表达和分泌。构建E.tarda的必须营养基因asd(天冬氨酸-β-半乳糖脱氢酶)突变株E.tarda△asd；将平衡致死质粒pYA3342(表达Asd和TEM-1)转入E.tarda△asd构建了以asd为筛选表记的E.tarda平衡致死系统；将具有表达和分泌功能的信号肽编码区域连入pYA3342(asd+)，在E.tarda△asd检测融合蛋白的表达和分泌，结果显示EseG 1个区域（EseG6）具有较高的表达和分泌功能；进一步研究显示，通过E. tarda平衡致死系统表达的EseG6在hela细胞和牙鲆头肾细胞可以介导报告基因TEM-1转运到宿主细胞内并定位在细胞膜上。上述结果说明pYA3342eseG6TEM-1asd在E. tarda△asd中可以呈递融合蛋白进入宿主细胞。将其他病原菌的抗原基因代替TEM-1连入pYA3342eseG6asd并转入E. tarda△asd建立异源蛋白呈递系统进行检测，结果显示嗜水气单胞菌的抗原GapA34（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）被呈递到牙鲆头肾细胞内并定位在细胞膜上。在此基础上，将pYA3342eseG6Gap34asd转入E.tarda△asd△purA疫苗株构建二价疫苗，免疫蓝曼龙并评价免疫保护效果，结果显示该二价疫苗对E.tarda和嗜水汽单胞菌的感染分别提供62.5%和55%的免疫保护力。研究表明，本项目以减毒迟缓爱德华氏菌疫苗为载体成功呈递了异源抗原，具有制备二价疫苗或多价疫苗的潜力。