自噬在纳米级碳黑致肺损伤过程中的作用及其机制研究

Nanoscale carbon black (CB) particles, one of important components of air fine particulate matter, which cause strong adverse effects. The mechanism for CB-induced health effects is related to oxidative stress. Autophagy is a stress response to various stimuli. High levels of autophagy may induce programmed cell death. Currently, the molecular mechanism of CB-induced autophagy is not fully defined. The potential role of autophagy remains unclear for health effects by particulate matter. Therefore, based on the CB aerosol dynamic inhalation exposure animal model, the change of autophagy level and the expression of genes related to autophagy formation are determined during the process of lung injury. The role of autophagy is elucidated in CB-induced lung tissue injury with its activator or inhibitor. Besides, human bronchial epithelial cell line (16HBE) and human lung epithelia cell line (A549) are used to carry out research on the toxicity of CB particles in vitro. The molecular mechanism of autophagy is further explored in CB-exposed lung cells through the interference of autophagy. In addition, the role of Nrf2 and the potential interactions are revealed in autophagy and apoptosis of CB-exposed cells by means of silencing Nrf2 gene in vitro. From in vitro and vivo levels and cell and molecular levels, we investigate the mechanism of autophagy in CB-induced lung injury to discover the key therapeutic targets and the effective biomarkers. These data might provide a theoretical basis for risk assessment and biological monitoring of environmental and occupational harmful factors.

纳米级碳黑颗粒是大气细颗粒物的重要组分，也是有害效应较强的成分之一，其健康效应机制与氧化应激有关。自噬是细胞在各种刺激因素下的一种应激性反应，自噬过度又会诱发细胞程序性死亡。目前碳黑颗粒引发自噬形成的分子机制、以及自噬在碳黑损伤中的作用仍不清楚。本研究首先建立动式吸入碳黑气溶胶染毒动物模型，检测肺损伤过程中自噬水平变化，以及自噬形成相关基因表达；通过抑制剂和激活剂干扰自噬探讨自噬在肺损伤过程中的作用。其次，以人支气管上皮细胞（16HBE）和人肺上皮细胞（A549）为研究对象，开展碳黑体外毒性研究，探讨自噬在肺细胞损伤中的分子机制；通过体外沉默Nrf2，揭示Nrf2在碳黑诱导细胞自噬和凋亡中的作用，并分析自噬和凋亡的关系。本研究通过体外与体内、细胞与分子相结合，揭示自噬在碳黑致肺损伤中的作用机制，发现疾病治疗关键靶点，寻找有效生物标志物，为环境和职业有害因素危险度评价和生物监测提供理论依据。

纳米级碳黑（CB）颗粒是大气细颗粒物的重要组分，也是有害效应较强的成分，其健康效应机制主要与氧化应激反应有关。在氧化应激条件下，机体激活抗氧化和自噬系统，启动氧化损伤的重要防线。目前，CB引发自噬的分子机制、以及自噬在CB致健康损伤中的作用仍不清楚。尽管Nrf2/ARE是机体重要的抗氧化通路，但是有关CB诱导Nrf2激活的上游调控机制尚未明确，特别是有关CB激活Nrf2/ARE通路在调控CB所致氧化应激、自噬和凋亡的报道甚少。本研究利用吸入CB染毒小鼠肺损伤模型、及CB染毒16HBE和A549细胞模型，探讨自噬和Nrf2/ARE通路在纳米CB诱导的氧化应激和氧化损伤中的生物学效应，阐明CB诱导的肺毒性效应与自噬、抗氧化通路之间的相互作用机制。.体内和体外结果证实：①CB暴露可引起ROS生成、抗氧化酶活性下降，炎症因子释放、细胞活力下降。②CB暴露可升高细胞自噬水平，活化自噬流，上调Atg5、Atg7、Beclin1、LC3II、LAMP-2而下调Rubicon，有利于自噬体膜的起始、延伸、成熟、融合。③自噬抑制剂3-MA可抑制LC3II表达，激活Caspase3和PARP活性，增加凋亡水平，减轻肺损伤；而自噬激活剂Rap使凋亡水平降低，但动物实验证实自噬过度激活也会加重肺损伤。④CB暴露可导致凋亡水平增加、及Caspase3、Caspase7、PARP活化，不仅下调Bcl-2和上调Bax、Caspase9活性，诱导线粒体凋亡途径，而且激活Fas、Caspase8活性，诱导死亡受体途径。⑤CB暴露可增加胞核Nrf2表达，降低胞质Nrf2表达，促进Nrf2核转位，增加ARE转录活性，上调HO-1、NQO-1、GCLC表达，而NAC可显著降低ARE活性和HO-1表达，进一步验证了CB可通过ROS激活Nrf2/ARE。⑥体外沉默Nrf2可显著升高ROS水平、自噬和凋亡水平。⑦用MAPK、AKT和ERK通路抑制剂预处理细胞，结果证实CB经PI3K/AKT通路激活Nrf2/ARE通路。.综合体内和体外实验结果我们推断，纳米CB暴露可诱导肺组织或细胞产生氧化应激，激活PI3K/AKT/Nrf2/ARE抗氧化通路，引发细胞自噬和凋亡，而抗氧化通路和自噬的激活可以降低CB所致肺组织或细胞的氧化损伤。本研究结果为阐明纳米CB损伤机制提供了科学依据，也为纳米CB肺疾病的防治提供了新思路。