组织蛋白酶S介导的牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导血管反应在慢性牙周炎发生发展中的作用及机制研究

Vascular endothelial cells stimulated by the periodontal inflammatory factors, which induce vascular pathological responses, has been an important direction of periodontal research in recent years. However, the precise inflammatory response and molecular mechanisms of regulating vascular are still unclear. Cathepsin S (CatS) , a lysosomal cysteine protease, mainly expressed in vascular endothelial cells(VECs) and mononuclear phagocytic cells. In the previous study, we found that the up-regulation of CatS expression in VECs (CD31) in inflammatory periodontal tissues of the patients. We detected that CatS deficiency suppress the increase of expression levels of CD31, vascular endothelial growth factor (VEGF) and related protein kinase phosphorylation in inflamed tissues of chronic periodontitis（CP） mice model. Besides, the mouse lung-derived VECs showed high expression of CatS under the stimulation of P.g.LPS. Therefore, the above results confirmed that CatS was closely related to the function of VECs. Based on these results, firstly, the current project intends to clarify the influence of CatS gene on VECs with the use of correlation methods such as immunohistochemical technologies, western blot by using Cats deficiency mice. Secondly, we will determine a new molecular mechanism of CatS in regulating VECs functions in pathogenesis and development of chronic periodontitis. Finally, we will parse the effect of CatS in endothelial progenitor cell-mediated vasculogenesis. We believe that our projects are meaningful to deepen the understanding of CatS physiological functions for exploring a new targeted therapy of CP.

血管内皮细胞在牙周致炎因子的刺激下导致血管病理性改变是近年来牙周病学研究的重要方向，但其炎性反应机理与分子调控机制仍未明确。组织蛋白酶S(CatS)存在于细胞的溶酶体中，主要表达于血管内皮细胞及单核吞噬细胞。在前期研究中我们首次发现慢性牙周炎患者炎症组织中血管内皮细胞(CD31)高表达CatS，同时检测到在慢性牙周炎小鼠模型中CatS基因缺失抑制CD31、VEGF及相关蛋白激酶磷酸化水平的升高，并且小鼠肺来源血管内皮细胞在P.g.LPS刺激下高表达CatS，以上结果证实CatS与血管内皮细胞功能密切相关。本项目拟利用该小鼠作为研究对象，通过采用免疫染色、western blot等实验方法明确CatS对血管内皮细胞功能的影响，阐明CatS调控其功能的新机制，解析CatS在血管内皮祖细胞介导的血管发生中的作用，对加深CatS重要功能的理解、探寻慢性牙周炎的靶向治疗具有非常积极的意义。

血管的病理性改变与牙周炎的进程密切相关，但其具体调控机理尚未明确。我们分别使用慢性牙周炎患者牙龈组织，CatS+/+小鼠肺来源血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞为研究模型，通过免疫荧光染色，Western blot及RT-PCR方法检测到血管内皮细胞高表达的CatS是促进牙周炎症反应的关键，并且受到转录因子PU.1，p65以及蛋白激酶pp38调控。另一方面，线粒体的动态平衡对于慢性牙周炎有重要影响。在现阶段的研究中，我们使用上述实验方法检测到线粒体裂变的关键调节因子线粒体动力相关蛋白（Drp1）在慢性牙周炎患者牙龈组织中形成多聚体的表达量升高，且在成纤维细胞模型(MEF细胞)中的Drp1过活化、易位后与线粒体外膜受体Fis1的结合对于溶酶体CatS的高表达具有一定的促进作用，同时使用ELISA法检测出促炎因子IL-6的表达量也有所升高。而在敲除了Drp1或Fis1的MEF细胞中，CatS和IL-6的高表达均被抑制。此外，使用共聚焦显微镜可观察到Raw细胞模型中ROS及P62 Puncta的产量增多，Western blot法所示的NLRP3表达量升高，表明线粒体形态改变会导致线粒体质量控制的改变及其功能异常，从而加剧了炎症及周围组织的损伤程度，说明线粒体质量控制的改变对慢性牙周炎的进程起关键性作用，以上研究为临床上治疗慢性牙周炎提供了新的靶点及科学依据。