类风湿关节炎特异性瓜氨酸化纤维蛋白原抗原表位及其致病分子机制的研究

类风湿关节炎（RA）以慢性致残性关节炎为特征的全身性自身免疫病。抗原多肽、人类白细胞抗原 (HLA)-DRB1及T细胞受体 (TCR) 三分子间的特异性识别和结合是本病异常免疫反应的始动环节。本课题组前期已从RA患者外周血循环免疫复合物中筛选鉴定出RA特异性自身抗原- - - - 瓜氨酸化纤维蛋白原，并且在RA患者体内检测到抗瓜氨酸化纤维蛋白原抗体（ACF），该抗体不仅对RA诊断具有高度特异性，还与疾病活动度相关。本研究对RA特异性瓜氨酸化纤维蛋白原进行表位功能、HLA-DRB1结合特性、T细胞活化和关节炎诱导能力进行实验研究，并对其翻译后修饰后抗原功能改变进行系统分析，从分子、细胞、HLA-DR4转基因小鼠和RA患者外周血不同层面研究了其在RA中致病的分子机制，使得瓜氨酸化纤维蛋白原在RA发病机制的研究上有重要进展。

本项目组前期研究发现早期RA患者纤维蛋白原（FIB）beta链第72位精氨酸发生了瓜氨酸修饰，而正常人该位点不存在瓜氨酸化修饰。RA患者天然瓜氨酸化位点FIB beta链第72位的精氨酸位于B细胞表位上。.合成了2条抗原肽，分别为原型肽FIB beta67-77 （SGGGYRARPAK）和瓜氨酸化纤维蛋白原（C-FIB）beta67-77（SGGGY R*ARPAK）两条肽（R*代表瓜氨酸）。通过ELISA方法检测类风湿关节炎（RA）患者原型和瓜氨酸化FIB beta67-77抗体水平。RA患者IgG、IgA、IgM型抗C-FIB beta67-77抗体滴度均高于非RA患者及健康对照组（P<0.01）。各组血清中抗FIB beta67-77 肽抗体滴度无差异。抗C-FIB beta67-77抗体IgG、IgA和IgM在RA中诊断的敏感性分别为50.7%、48.5%和55.1%；特异性分别为94.8%、92.7%和92.4%。联合检测三个亚型敏感性为87.7%，特异性可达78.5%。尤其对IgM-RF、AKA、APF及抗CCP抗体阴性RA的诊断具有参考意义。抗C-FIB beta67-77抗体阳性组患者的晨僵时间、关节肿胀数、疼痛数、小关节受累数目、疾病活动度评分（DAS28）、关节炎影像学分级均明显高于该抗体阴性组。阳性组的血沉、C反应蛋白、IgG和类风湿因子均明显高于抗体阴性组。抗C-FIB beta67-77抗体与RA的疾病活动度和骨质破坏密切相关。RA患者PBMC对C-FIB beta67-77和FIB的增殖反应均略高于对照组，但两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。C-FIB beta67-77与priess细胞表面的HLA-DR4分子发生了特异性的结合。.筛选鉴定出C-FIB alpha链FIB alpha 127-139（R*VSEDL R*SR）（R*瓜氨酸化）为T细胞抗原表位。结合试验证明C-FIB alpha127-139与HLA-DR分子特异性结合，并可以被抗HLA-DR的单抗竞争性抑制，而原型肽与HLA-DR4分子的结合较弱或未结合，即瓜氨酸化修饰增加了FIB多肽与HLA-DR4分子的结合力。通过HLA-DRB1限制性细胞系进行T细胞增殖试验研究结果示C-FIB alpha127-139对T细胞的激活能力高于原型肽（P＜0.05）。