内质网应激致冠心病内皮功能障碍的分子机制研究

内皮功能障碍是冠心病防治的重要靶点，课题组前期工作证实，内质网应激致血管内皮损伤。本项目提出冠心病缺血（氧）启动内皮内质网应激反应，通过PERK/eIF2α 途径抑制分泌型蛋白合成、折叠，致内皮功能障碍的观点。拟采用免疫细胞化学、实时定量PCR方法研究冠心病患者循环内皮细胞内质网应激，ELISA法测定内皮旁自分泌物质，证实冠心病患者存在内皮内质网应激和旁自分泌功能障碍；进一步在大鼠心肌梗死和心肌微血管内皮细胞缺氧/复氧模型上，研究冠脉内皮细胞内质网应激反应及其与内皮和心肌损伤的关系，证实冠脉内皮细胞内质网应激是导致其旁自分泌功能障碍和心肌损伤的重要环节；在此基础上，研究干预PERK/eIF2α活性对于内皮细胞损伤、旁自分泌功能的影响，证实PERK/eIF2α是冠心病内皮损伤、功能障碍的关键信号途径。从改善内皮功能的角度为冠心病防治提供新的干预靶点，并为评价内皮功能障碍提供新的生物标志分子。

内皮细胞缺血（氧）造成内皮功能障碍是血管损伤相关疾病的共同机制，阐明其机制将为冠心病、动脉粥样硬化、高血压等血管损伤相关疾病的防治提供新途径。缺氧预处理通过短暂缺氧调动机体对于后续长时间缺氧损伤的抵抗，是一种内源性细胞保护现象。内质网应激(endoplasmic reticulum stress)是指以未折叠/误折叠蛋白聚集和钙稳态失衡为主要特征的内质网功能紊乱状态。一定程度的内质网应激有利于细胞恢复自稳态和修复损伤，过度严重的内质网应激通过内质网应激相关细胞凋亡加重细胞损伤。蛋白激酶R样内质网激酶 (protein kinase R-like ER kinase, PERK) 是介导内质网应激的主要信号分子之一，通过磷酸化真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)，调节蛋白合成和细胞凋亡。本工作首先在原代培养心肌MVECs缺氧/复氧模型上，研究心肌微血管内皮细胞的损伤过程中内质网应激反应，证实缺氧/复氧诱导严重的内质网应激反应，表现为内质网应激分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、钙网蛋白表达上调、内质网应激相关凋亡途径活化；在内质网应激诱导剂毒胡萝卜素诱导微血管内皮细胞损伤模型上，发现内质网应激诱导剂可以直接引起MVECs显著损伤，促进细胞骨架破坏和通透性增加，表明内质网应激是缺氧/复氧引起细胞损伤的重要机制之一，PERK/eIF2α是冠心病内皮损伤、功能障碍的关键信号途径；进一步研究内源性保护现象缺氧预处理（HPC）对于内质网应激及其所致微血管内皮细胞损伤的影响，证实HPC通过诱导适度内质网应激、抑制CHOP介导的内质网应激相关凋亡途径而减轻MVECs损伤及细胞骨架破坏，提示HPC的内源性保护机制可能涉及直接抑制CHOP介导的过度内质网应激反应。在此基础上，本工作进一步探讨微血管内皮细胞损伤的防治机制，采用外源性钙网蛋白预处理心肌微血管内皮细胞，证实外源性钙网蛋白预处理可以减轻微波辐射所致微血管内皮细胞凋亡与乳酸脱氢酶漏出、骨架排列紊乱，改善内皮细胞黏附、铺展和迁移等功能，其机制涉及减轻内质网应激反应，上述结果从调控内质网应激的角度为内皮功能障碍相关疾病的防治提供了新的治疗靶点。