miR-146a通过靶向TLR4信号通路调节LPS诱导大鼠远端肺动脉平滑肌细胞合成分泌功能的研究

synthesis and secretion function of pulmonary artery smooth muscle cells ( PASMCs ) is important in the early pulmonary vascular remodeling. Evidence now suggests that PASMCs express Toll-like receptor 4（TLR4）. TLR4 activity not only innate immunity but ultimately also adaptive immunity. Whether the activation of IRAK-NF-κB signaling pathways mediated by TLR4 regulate and control the synthesis and secretion of PASMCs have not been reported； MiRNA-146a has the negative effect targeting to TLR4 signaling pathways，thus speculate that microRNA-146a regulate Lipopolysaccharide induced synthesis and secretion in distal pulmonary artery smooth muscle cells of rat by targeting toll-like receptor 4 signaling pathway. In our project, the primary culture of rats pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) will be performed, using siRNA and miRNA technology, to study the role of miRNA146a in LPS induced synthesis of PASMCs secretion by targeting TLR4 - IRAK - the NF-kappa B pathway at a cellular level .in addition，establishing the rat model of COPD to study the possible molecular mechanism of miRNA-146a involved in the PASMCs synthesis and secretion function by transfection of pre-miRNA146a to animal model. This study provide the new intervention targets to preventing the early COPD pulmonary vascular remodeling.

肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的合成分泌功能在COPD早期肺血管重塑中起关键作用。研究发现，PASMCs有TLR4表达，TLR4是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁，TLR4介导的IRAK-NF-κB信号通路活化是否参与调控PASMCs合成分泌功能未见报道。miRNA-146a对TLR4信号通路调具负性调控作用，因此推测，miRNA146a通过靶向TLR4信号通路调控PASMCs的合成分泌功能。本项目利用siRNA、miRNA技术，分离、培养PASMCs，首先在细胞水平探讨miRNA146a靶向TLR4-IRAK-NF-κB信号通路在LPS诱导PASMCs合成分泌功能中的作用；其次建立COPD大鼠模型，通过体内转染pre-miRNA146a，从整体动物水平探讨miRNA146a调节PASMCs的合成分泌功能及其可能分子机制。以期为早期防治COPD肺血管重塑提供新的干预靶点，具重要的科学意义。

本项目通过分离、培养及鉴定大鼠远端肺动脉平滑肌细胞，模拟COPD主要致病因素之一，以脂多糖刺激，检测大鼠远端肺动脉平滑肌细胞合成分泌Th1细胞因子、Th2细胞因子及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、血小板衍化生长因子（PDGF）的情况；以TLR4抑制剂、IRAK抑制剂、NF-κB抑制剂为工具药，探讨TLR4- IRAK-NF-κB信号通路在脂多糖诱导大鼠远端肺动脉平滑肌细胞合成分泌功能中的作用；并利用质粒转染技术，探讨miR-146a对LPS诱导大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的合成分泌功能的调节作用，并检测miR-146a对TLR4信号通路的负性调节作用。研究结果：（1）LPS诱导可使PASMCs中TLR4的表达上调，同时PASMCs合成分泌INF-γ、IL-6、MCP-1、TGF-β1、PDGF增加，且TLR4表达水平与合成分泌IFN-γ、IL-6和PDGF呈时效、量效正相关性。TLR4的特异性抑制剂TAK-242阻断TLR4，同时PASMCs合成分泌INF-γ、IL-6、MCP-1、TGF-β1、PDGF的水平降低，但MCP-1、TGF-β1下降幅度无统计学差异，因此我们推测TLR4可能参与调控PASMCs合成分泌功能。以IRAK抑制剂、NF-κB抑制剂为工具药，进一步证实TLR4- IRAK-NF-κB信号通路调控LPS诱导下大鼠远端肺动脉平滑肌细胞的合成分泌INF-γ、IL-6、MCP-1。（2）LPS能够诱导肺动脉平滑肌细胞中miR-146a表达上调，并于72小时维持在较高水平。外源性microRNA-146a能负性调节TLR4信号通路中相关分子的蛋白表达，并通过TLR4-IRAK-NF-κB信号通路下调肺动脉平滑肌细胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB，但IL-6水平不降反有升高，其原因还待进一步研究。本项目证实TLR4-IRAK-NF-κB信号通路在肺动脉平滑肌细胞的合成分泌功能中起主要的调控作用，阻断TLR4信号通路能改善相同刺激条件下PASMCs的合成分泌功能； LPS能够诱导肺动脉平滑肌细胞中miR-146a表达上调，外源性microRNA-146a通过TLR4-IRAK-NF-κB信号通路下调肺动脉平滑肌细胞合成分泌IFN-γ、PDGF-AB。为早期防治COPD肺血管重塑提供新的干预靶点，具重要的科学意义。