滑膜肉瘤SYT/SSX融合蛋白辅助转录因子的筛选及对靶基因转录激活的影响

Synovial sarcoma is a common type of soft tissue sarcoma.More than 90% of synovial sarcomas possess a non-random chromosomal translocation t(X;18)(p11;q11) and express SYT/SSX fusion protein.Fusion protein is a strong transcriptional activator,resulting in a large number of target genes abnormal transcription.At the same time, the process requires a large number of auxiliary transcription factors.Different transcriptional factors involve in the process of transcriptional activation of the different target genes,producing impacts on different biological behaviors of synovial sarcoma.In this research program, we intend to purify the cooperative interactive protein moleculars for SYT/SSX protein by the Tandem Affinity Purification (TAP) system, which is manipulated as: constructing a fusion protein of TAP and SYT/SSX, tranfecting the plasmid to the HS-SY-Ⅱ cells whose SYT/SSX is knocked off, purifying the fusion protein by affinity column. Then, the biological attribute of the purified proteins would be identified by mass spectrum.Subsequently, we would apply the GSEA (gene set enrichment analysis) to explore the interactive protein moleculars' activation on the characteristic target genes of synovial sarcoma listed in the appendix. Eventually, we would conclude from the result that different interactive protein moleculars' influence on the specific biological behavior of synovial sarcoma. Furthermore, this research program would extend the mind of the molecular etiology of synovial sarcoma, and would make significant foundation for the signal pathway based genetic target therapy.

滑膜肉瘤是较常见的软组织恶性肿瘤，90%以上的滑膜肉瘤都具有由于特异性染色体易位产生的SYT/SSX融合蛋白，而融合蛋白发挥的强转录激活作用，导致大量的靶基因异常转录翻译，同时，融合蛋白影响靶基因转录的过程需要大量辅助转录因子的协同作用，不同的转录因子协同参与不同靶基因的转录激活，从而对滑膜肉瘤的不同生物学行为产生影响。本研究拟采用串联亲和纯化的方法检测SYT/SSX融合蛋白与细胞蛋白的相互作用，分离和鉴定出和融合蛋白特异性发生作用的蛋白质大分子，并利用基因功能集合富集度分析方法从基因组水平分析特异性的结合转录因子对SYT/SSX转录激活的影响。通过对特异性结合转录因子的筛选和研究，为滑膜肉瘤的分子病因学的研究，也为以后建立在滑膜肉瘤胞内信号通路基础上的靶向治疗提供重要的实验基础和理论依据。

滑膜肉瘤特异性融合基因SYT/SSX1 (目前称SS18-SSX1)已被证实在滑膜肉瘤发生发展中起重要作用，然而，目前关于SYT/SSX1 的转录调控机制尚不十分清楚，SYT/SSX1在滑膜肉瘤中的信号调节网络以及分子功能还有待进一步研究。本课题对SYT/SSX1在滑膜肉瘤中的异常表达的转录调控机制进行了研究，并通过体内外实验初步探讨了SYT/SSX1在滑膜肉瘤治疗中的意义及其相关机制，研究主要从以下几个方面进行：1） SYT/SSX1下游靶基因的筛选及鉴定；2） SYT/SSX1下游靶基因的功能学分析；3） SYT/SSX1下游靶基因的信号传导通路的鉴定；4） SYT/SSX1启动子活性区域的鉴定；5） SYT/SSX1启动子与靶转录因子的相互作用鉴定；6） 靶转录因子调控SYT/SSX1表达的分子机制。研究发现：1）新发现SYT/SSX1下游效应分子20个，该20个基因与肿瘤发生发展关系密切，并未见有文献在滑膜肉瘤中报道；2）通过对上述20个基因进一步行功能学分析，共鉴定出4个与肿瘤增殖密切相关阳性基因，即SHCBP1，NID2， HOXC11和FLVCR1；3）证实SHCBP1在肿瘤组织中高表达，SHCBP1表达强度与肿瘤恶性分级和患者预后密切相关；证实SHCBP1通过激活MAPK/ERK，PI3K/AKT信号通路促进肿瘤细胞增殖；证实SHCBP1通过激活TGF-β1/Smad信号通路促进肿瘤细胞发生EMT进而促进肿瘤细胞转移；4）通过对人SYT/SSX1基因启动子序列进行了分析，确定了SYT/SSX1启动子活性区域位于-268～-116, 该区段GC富集，结合软件分析结果，预测AML1a很有可能为调控SYT/SSX1基因最关键的转录因子；5）明确了AML1a蛋白作为转录因子与SYT/SSX1启动子的结合；6) 通过构建荧光素酶报告基因重组质粒，并检测荧光素酶活性变化情况，提示-268～-116片段为SYT/SSX1基因的核心启动子区，转录因子AML1a很可能通过与该区段的结合实现对SYT/SSX1基因的调控。本研究结果为阐明 SYT/SSX1基因转录调控机制以及进一步深入研究 SYT/SSX1在滑膜肉瘤发生发展中的作用提供有力依据。