PI3K/Akt信号通路激活对急性心肌梗死的保护作用和机制研究

心肌细胞凋亡参与了急性心肌梗死（AMI）的病理过程，AMI采用溶栓和腔内成形术治疗，常发生心肌缺血-再灌注损伤，尤其细胞凋亡和坏死，导致AMI 病情加重。本课题制备大鼠AMI的动物模型和细胞模型，研究急性心肌缺血对心肌组织内源性PI3K/Akt代谢的影响，观察PI3K/Akt组分和调节酶PTEN的消长规律，并给予外源性PI3K、Akt，PI3K激动剂、PI3K抑制剂、转染重组PI3K、Akt基因的腺病毒载体进行干预，采用RT-PCR、免疫组化、Western blot法分析PI3K/Akt信号通路激活对AMI时心肌细胞凋亡的抑制作用，观察干预前后心肌组织结构和功能改变及心肌组织或细胞内PI3K、Akt含量，以此揭示PI3K/Akt信号通路激活对AMI的保护作用和机制。

本研究采用分子生物学手段，在细胞和整体水平，制备了大鼠心肌缺血损伤模型，成功构建了人磷脂酰肌醇3-激酶p110γ(PI3KCG)的慢病毒载体PLV-PI3KCG，给予重组PLV-PI3KCG慢病毒载体干预，发现PI3KCG对心肌缺血损伤具有保护作用。在细胞水平，培养乳大鼠原代心肌细胞，实验分五组，即 (1) 正常对照组，(2)缺氧复氧组（H/R组），(3) 缺氧复氧+空载体阳性对照组（HRE组），(4) 缺氧复氧+PI3KCG实验组（HRP组），(5)缺氧复氧+PI3KCG+Ly294002组（HRPL组），实验用培养第3d 原代心肌细胞，制备心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。利用同源重组的方法制备PLV-PI3KCG慢病毒重组质粒，将PLV-PI3KCG重组质粒转染乳大鼠心肌细胞，比较各组心肌细胞的搏动频率及存活率，检测心肌细胞上清中的LDH活性，分析PI3K/AKT信号通路蛋白质表达。结果发现，与H/R 组比较，HRP组心肌细胞培养液中LDH 水平明显降低(P<0.01)；心肌细胞的存活率、搏动频率明显升高(P<0.01)。重组PLV-PI3KCG质粒转染心肌细胞后，PI3KCG, Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白下降，LY294002可减弱PLV-PI3KCG质粒介导的Bcl-2 蛋白增加和Bax蛋白下降。在体水平：采用冠脉结扎法成功制备了大鼠急性心肌梗死模型，揭示了PI3K/AKT信号通路激活对急性心肌梗死大鼠具有保护作用。实验分为：（1）假手术组 （2）急性心肌梗死组 （3）急性心肌梗死+PLV-PI3KCG组。结果发现，大鼠急性心肌梗死手术10天后，左室舒张末期直径扩大，左室射血分数较前明显减低，予心肌梗死区边缘注射重组PLV-PI3KCG后，左室舒张末期直径较前缩小，左室射血分数较前改善(P<0.05)。各组的室间隔厚度，左室后壁未见明显统计学差异(P>0.05)。PI3K/Akt信号通路激活与心肌缺血损伤密切相关，PI3KCG基因对急性心肌梗死损伤具有保护作用。