微波辅助固定化酶蛋白酶解及其在生物活性肽制备中的应用研究

生物活性肽是由蛋白质水解得到的以氨基酸为单体的一类物质，其分子量小于蛋白质，具有高的生物活性，是生物医药研究领域一类具有广阔应用前景的功能因子。本课题研究微波辅助固定化酶技术及其在生物活性肽分析及制备中的应用，通过微波辅助酶解技术激活生物体细胞膜及膜内的酶-基质相互作用，使蛋白质酶解在短时间内迅速完成。利用固定化酶技术具有高的酶/底物比、高的酶解效率、可重复使用并能减少酶的自身降解、酶解产物与酶易分离的特点，用载体将酶束缚或限制，使酶分子在一定区域内进行特有和活跃的催化作用，在提高酶解效率和酶使用效率的同时，保持蛋白酶解产物高的生物活性。以具有生物活性的小分子肽链为酶解目标研究酶解过程的控制、酶固定化技术的实现以及生物活性肽的分离与分析，为生物活性肽的制备、分离、纯化研究提供技术支持。对深入研究微波辅助固定化酶酶解蛋白的机理，发展从天然产物中提取分离生物医药功能因子具有重要的意义。

本课题采用微波辅助固定化酶酶解技术对银杏蛋白以及广西黑蚂蚁蛋白进行了酶解技术的研究，采用Tricine SDS-PAGE凝胶电泳、HPLC以及LC－MS对两种蛋白酶解液中的多肽进行了分析。同时测定了酶解液中多肽生物活性。戊二醛交联氨基化的磁性Fe3O4粒子可实现菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的高效固定化。磁性纳米粒子修饰金属离子螯合固定化木瓜蛋白酶再生率高，再生后酶活稳定；以MAA和EGDMA聚合有机薄层为支撑，填充氨基化修饰、戊二醛激活的有机-无机杂化硅球实现胰蛋白酶的固定化且易再生。在微波辅助功率300 W，酶解时间30 min，底物浓度0.01 g/mL，酶底物比4500 U/g，温度55℃，pH 7.0的条件下银杏蛋白酶解效果最佳且酶解产物抗氧化活性高于自由酶酶解。而基于磁性微球的固定化菠萝蛋白酶在相同条件下酶解，多肽分子量分布在7823-5856 Da之间较多，小部分在5856-3313 Da之间，HPLC分析表明固定化酶酶解和自由酶酶解有着极其相似峰轮廓。在温度50 ℃、底物浓度0.02 g/mL、酶解时间60 min、给酶量5500 U/g条件下，微波辅助结合木瓜蛋白酶可有效酶解蚂蚁蛋白。采用磁性纳米粒子修饰金属离子螯合固定化木瓜蛋白酶微波辅助酶解蚂蚁蛋白在酶解时间30 min内可获得较丰富、稳定的肽段。连续微波辅助结合固定化菠萝蛋白酶可高效酶解银杏蛋白，与常规酶解和非连续微波辅助蛋白酶解对比，连续微波功率有利于亲水性氨基酸酶切点的酶解，亲水性氨基酸酶切位点比例达42.8%，高于而常规酶解和非连续微波辅助蛋白酶解。500W连续微波功率下银杏蛋白主要酶切点在精氨酸(R)位置，且亲水性氨基酸酶切位点比例稳定在55%。连续微波辅助结合胃蛋白酶在酶底物比为7000 U/g，酶解时间为5 min时，酶解蚂蚁蛋白获得的多肽对ACE抑制能力最强，表明蚂蚁蛋白酶解物具有潜在的降血压功效。LC-MS分析酶解液可推测蚂蚁蛋白原液中的抗ACE活性肽氨基酸序列为VAIQ，通过酶解获得的抗ACE活性肽氨基酸序列为AGDDAPRAVF，SYVGDEAQSKRGILT和YALPHAIL。建立了分子印迹固相萃取-液相色谱-电喷雾串联质谱（mMI-SPE-LC-MS/MS）联用测定植物样品中四种细胞分离素方法并成功应用于植物组织样品中四种细胞分裂素的选择性萃取和检测。