针刺镇痛效应的脊髓小胶质细胞阿片受体竞争抑制机制

The central immune signalings in microglia induced via opioid action amplification of classic opioid receptors and via activation of toll-like receptor (TLR)-dependent signaling suggest a competition between the "analgesia" and the "hyperalgesia". Our previous research displayed a cumulative analgesic effect of repeated electroacupuncture (EA) stimulation of Zusanli (ST36)-Yanglingquan (GB34), accompaning with a decreased TLR4 expression in the spinal dorsal horn. Whether EA intervention induced an inhibition of the TLR-dependent immune signaling by activation of the classic opioid receptors results in pain relief? It remains unclear up to now. The present study is designed to examine the dynamic changes of endogenous opioid peptides, TLR4 and classic opioid receptors (μ, κ and δ) of the microgliacytes in the lumbar spinal dorsal horns after EA treatment in chronic neuropathic pain rats by using real-time PCR, western blot, fluorescent immunohistochemistry, confocol laser scanning microscope, enzyme linked immunosorbent assay, flow cytometry, intrathecal injection of specific antagonists of some downstream signaling pathways, etc., so as to determine their relationship during pain development and analgesic process, and to validate the contribution of these two types opioid receptors induced immune signalings to acupuncture analgesia. This study will provide scientific evidence for reveling the mechanism of acupuncture intervention induced reduction of chronic neuropathic pain by regulating spinal immunocellular signaling.

阿片肽与脊髓背角小胶质细胞上的阿片经典受体和toll样受体(TLR)结合分别诱导"镇痛"与"痛敏"两种相反的中枢免疫信号，二者具有竞争抑制作用。申请者以往的实验结果表明，电针产生累积镇痛效应时，脊髓背角TLR4的表达明显下降。那么，电针是否通过激活小胶质细胞上的经典阿片受体途径而抑制了TLR的表达？这可能与针刺镇痛效应直接相关。本研究通过观察CCI大鼠脊髓背角小胶质细胞上这两种阿片受体诱导的免疫信号在电针干预不同时期的动态变化来分析阿片经典受体对TLR的抑制作用及相关机制，并特异性阻断阿片经典受体下游相关的免疫信号通路，分析这些免疫信号在电针镇痛中的贡献度。通过在小胶质细胞上分析针刺调动内源性镇痛的机制，把针刺镇痛研究推进到细胞免疫的更高层次，为证明针刺如何充分调动机体的内源性镇痛系统，进一步提高临床疗效奠定理论基础。

目前的研究认为小胶质细胞是中枢免疫的中心，小胶质细胞自身有很多表面受体，这些受体接受来自配体的信号后，激活胞内的信号传导途径介导胞核的基因转录翻译，进而分泌相应的细胞因子与神经元和其它免疫细胞相互作用。研究小胶质细胞自身受体在针刺镇痛中的相互作用为我们在单细胞上研究针刺镇痛效应机制提供了突破口。本研究在在慢性结扎损伤(chronic constriction injury, CCI)大鼠模型上，观察了电针刺激“足三里-阳陵泉”后动物痛敏变化，运用Quantitative real-time PCR、Western blot、免疫组织化学、单细胞分离培养等技术对脊髓腰段内小胶质细胞上代表“镇痛”与“痛敏”的阿片肽和toll样受体(TLR)及相关的下游通路进行了检测。.结果显示，CCI后，大鼠的辐射热痛阈值明显降低，电针5次后，大鼠的辐射热痛阈值升高，出现明显的镇痛效应。CCI后，脊髓背角TLR4表达升高，而3种阿片肽及其受体变化不明显。电针5次后，脊髓背角TLR4表达明显下降，3种阿片肽及其受体都有升高的趋势，但变化幅度不同。CCI及电针后分离脊髓腰段内小胶质细胞后，检测显示，CCI后小胶质细胞上有多个分子表达发生变化，其中包括TLR4，电针后不同时间（EA2次和EA7次）脊髓腰段内小胶质细胞中变化的分子略有差异，但不同电针时间后，3种阿片肽受体都有变化。这些结果进一步证实了脊髓小胶质细胞通过TLR4和阿片肽及其受体参与了针刺镇痛效应。本研究进一步对电针后TLR4和阿片间的相互影响进行了研究，发现电针可通过3条途径对小胶质细胞产生调节发挥镇痛效应（1）降低TLR4共刺激分子HSP90的表达；（2）升高小胶质细胞上的DOR而抑制P物质受体的表达；（3）升高小胶质细胞上KOR的表达而抑制TLR4下游TAK1通路。.本研究通过在小胶质细胞上分析针刺调动内源性镇痛的机制，把针刺镇痛研究推进到细胞免疫的更高层次，为证明针刺如何充分调动机体的内源性镇痛系统，进一步提高临床疗效奠定了部分理论基础。