μ/δ阿片受体异聚体活化小胶质细胞介导吗啡耐受的分子机制研究

Chronic morphine treatment can induce morphine tolerance which limits its clinical application. Our previous studies have found that spinal glial activation and proinflammatory cytokine release play a critical role in the formation of morphine tolerance. However, the target receptors and the specific mechanisms that morphine activates glial cells are still unclear. The latest studies confirmed that μ/δ-opioid receptor heteromers plays an important role in the regulation of analgesic response, and our previous preliminary experiments had found that it is involved in morphine tolerance. On the basis of these views and our previous work, we put forward the scientific hypothesis that "μ/δ-opioid receptor heteromers is the target receptor through which morphine activates spinal microglia and leads to morphine tolerance". In this research subject, from the macro level, we will explore the effect of μ/δ-opioid receptor heteromers on morphine tolerance and its unique pharmacological activity as well as the corresponding ligands in rat; From the micro level, we will observe the effect of morphine on μ/δ-opioid receptor heteromers formation, endocytosis and degradation and explore the mechanisms and signaling pathways using fluorescence protein fusion gene cell transfection techniques, confocal microscopy imaging in real time systems, fluorescence resonance energy transfer and other key technologies. This subject will help to elucidate the mechanisms of morphine tolerance and provide new ideas to prevent and treat it directly.

长期应用吗啡造成的吗啡耐受限制了其临床应用。我们前期研究发现脊髓胶质细胞活化及促炎因子释放在吗啡耐受中起着重要作用,但是吗啡活化胶质细胞的靶受体及具体机制尚不清楚。最新研究证实μ/δ阿片受体异聚体在调控痛觉缺失中发挥着重要作用，我们前期预实验发现其参与了吗啡耐受的过程。据此结合先前的工作基础，我们提出了“μ/δ阿片受体异聚体是吗啡活化脊髓小胶质细胞引起吗啡耐受的靶受体”这一科学假说。本课题拟在吗啡耐受大鼠模型上，从宏观上明确μ/δ阿片受体异聚体在吗啡耐受中的作用，对其独特的药理活性和相应配体进行研究；在小胶质细胞上，应用荧光蛋白融合基因细胞转染技术、激光共聚焦显微镜细胞实时成像系统，荧光共振能量转移等关键技术，从微观上观察吗啡对μ/δ阿片受体异聚体形成、内吞、降解的影响及其活化小胶质细胞的可能机制和信号通路。本研究课题将有助于阐明吗啡耐受产生的调制机理，为靶向防治吗啡耐受提供新的思路。

吗啡作为阿片类药物的代表，在治疗急、慢性疼痛，特别是术后镇痛中，至今仍具有不可替代性。然而长期应用吗啡可造成一系列阿片相关副作用，如耐受（tolerance）、成瘾和便秘等。其中镇痛耐受对吗啡临床应用的限制作用最为关键。目前，吗啡耐受机制仍未明确，这导致难以获得解决该副作用的有效手段。该项目通过评价μ/δ 阿片受体异聚体对小胶质细胞活化状态的影响，进而探究其对吗啡耐受的调控机制。在对吗啡耐受的骨关节炎性疼痛大鼠鞘内连续3周注射云芝多糖肽（Polysaccharopeptide from Trametes Versicolor, TPSP）后，大鼠机械痛和热痛反射阈值均显著降低，大鼠脊髓中大麻素2型（CB2）受体的活性和亲和力显著升高，同时伴随β-内啡肽水平的上调和NO、PGE2、IL-1水平的下调，从而抑制骨关节炎性疼痛大鼠吗啡耐受的进展。此外，单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1, MCP-1）能够在PI3K/Akt信号通路的参与下活化原代小胶质细胞并促进P2X4R的表达；在癌性骨痛（Cancer-induced bone pain, CIBP）大鼠模型中进行体内实验出现了类似的分子生物学变化。另外，低浓度吗啡(0.1 μM)可活化HAPI小胶质细胞主要向M2型极化，该过程伴随MOR-P2X4R-BDNF信号通路的激活，将该处理的HAPI小胶质细胞用于大鼠体内，出现机械和热痛觉过敏；而高浓度吗啡(100 μM)促使HAPI小胶质细胞活化为M1型，表现出与低浓度吗啡相反的作用。最后，应用针对μ阿片受体（MOR）羧基端磷酸化位点氨基酸序列人工合成的多肽作为分子探针手段的动物镇痛筛选实验发现，375STANT379和Thr394的磷酸化可直接招募β-arrestin2蛋白，引起MOR胞内吞，造成吗啡脱敏和耐受。而β-arrestin2的募集是μ/δ 阿片受体异聚体形成的关键因素。该项目不仅揭示了μ/δ 阿片受体异聚体及小胶质细胞活化状态对吗啡耐受的影响，而且从其上游的阿片类药物作用起始阶段——MOR受体磷酸化程度进行探究，为研究吗啡耐受的机制和治疗提供了新的思路和药物靶点。