钙网蛋白突变体作为骨髓增殖性肿瘤检测标志物和CAR-T细胞治疗靶向抗原的应用及机制研究

The myeloproliferative neoplasms (MPNs) are chronic myeloid cancers characterized by the overproduction of mature blood cells. There is no known cure for the disease. CALR mutations are the founder gene alteration in the JAK2- and MPL-negative MPNs according to the WHO diagnostic guidelines. Methods that detect CALR mutations at the DNA levels cannot accommodate the performance needs of mutation diversity, sensitivity, rapidness, and cost-effectiveness. All CALR mutations lead to +1 base-pair frame-shifts in the open reading frame of the gene and result in a novel C-terminal mutant peptide consisting of 36 amino acids. With an in-house made specific monoclonal antibody targeting this peptide, we propose to detect the CALR mutation protein on peripheral blood cells surface by the flow cytometry. We intend to provide a simple, fast and quantitative method for the MPNs detection with any types of CALR mutation. We will also validate the tumor-killing effect of an anti-CALR chimeric antigen receptor T cell targeting the CALR mutant peptide both in vitro and in vivo, and the inflammatory response induced by cytokine secretion, thus provide a new therapeutic strategy for the patients with late stage MPNs.

经典的骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，目前无法治愈。钙网蛋白（CALR）突变见于大多数无JAK2或MPL基因突变的MPN患者，被纳入WHO诊断指南。检测CALR基因突变的方法无法兼顾突变类型多、灵敏高、检测快和成本效益好等需求。所有形式的CALR突变都会因+1bp移码导致共有的异常C末端肽段，我们对此肽段制备了特异性单抗，拟利用此抗体通过流式细胞术检测患者外周血细胞表面上的CALR突变蛋白，为MPN诊断提供一种简便、快速、可检测所有CALR突变类型的新方法；同时获取单抗单链可变区序列，以CD137为共刺激分子，T细胞受体(TCR)/CD3的-δ链为胞内信号结构域来构建第二代嵌合抗原受体。从而探索靶向突变CALR抗原的CAR-T细胞在体内、体外对CALR突变阳性血液肿瘤细胞的靶向杀伤作用及细胞因子分泌引起的炎性反应，为晚期或高危MPN患者提供新的治疗策略。

经典的骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一组起源于造血干细胞并以一系或多系血细胞扩增为特征的恶性克隆性疾病，包括真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，可造成重型贫血、急性白血病转化等严重临床后果。钙网蛋白（CALR）的基因突变是MPNs发生的驱动性事件之一，现有检测CALR基因突变均基于核酸扩增的方法，无法兼顾突变类型多、灵敏高、检测快等临床需求。几乎所有形式的CALR突变都会因+1bp移码突变导致一致的羧基端肽段突变。项目组在本研究仲1）根据此突变肽段制备了针对CALR突变蛋白的单克隆抗体，建立了基于此单抗的免疫组织化学及流式细胞术方法检测MPN患者骨髓组织中的CALR突变蛋白，为MPN检测提供了相比于传统基因扩增更为简单、快速、更具备成本效益的检测方法。2）获取单抗单链可变区序列，构建经典的以4-1BB（CD137）为共刺激分子，T细胞受体CD3δ为胞内信号域的第二代嵌合抗原受体，证明了靶向突变CALR蛋白的CAR-T细胞对体外CALR突变阳性细胞的结合和杀伤作用，探索其引发的脱靶效应及细胞因子分泌等炎症反应。针对CALR共性突变氨基酸末端建立的自主知识产权单抗为MPNs的临床诊断提供一套全新的蛋白质层面检测方法学；而对于靶向突变CALR蛋白的CAR-T细胞免疫治疗的探索，则为高危MPN患者提供了新的治疗思路，拓展MPNs患者的治疗工具库。