基于调控TGF-β1/wnt/β-catenin与PPARγ通路的金水缓纤方治疗肺纤维化的机制

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a major disease in the world with severely damage in public health, while there are no effective treatments. The balance disturbance of fibrosis and anti-fibrosis in alveolar damage repair is the key point of the pathogenesis. Based on Chinese medicine theory and confirmed clinical curative effect of Jinshui Huanxian Granules, the following researches will be carried out: ①To observe the effects of Jinshui Huanxian Granules in IPF rats model and explore the mechanism by measuring lung function, pulmonary pathology, fibrosis factors (CTGF, Fn1, α-SMA) and the indicators of signaling pathway (TGF-β1, Wnt1, β-catenin, PPARγ); ②To explore the effects of Jinshui Huanxian Granules in A549 and MRC-5 cell line and its mechanism in alveolar damage repair by using the technologies of β-catenin gene silencing and PPARγ slow virus activation and measuring EMT(E-cadherin,Fn1,α-SMA), as well as the relevant genes and proteins expressions of signaling pathway. The aim of this study is to explore the mechanism of Jinshui Huanxian Granules via TGF-β1/Wnt/ β-catenin and PPARγ signaling pathways and provide a basis for clinical application.

特发性肺间质纤维化（IPF）严重危害公众健康，缺乏有效治疗手段。肺泡损伤修复中致纤维化与抗纤维化的平衡紊乱是其主要病理生理环节。本研究基于“正虚络痹积损”的病机及确证的金水缓纤方临床疗效，拟开展①以肺纤维化大鼠模型为研究对象，采用免疫组化、激光共聚焦、qPCR等技术，测定肺功能、纤维化相关因子（CTGF、Fn1、α-SMA等）、信号通路（TGF-β1、Wnt1、β-catenin、PPARγ等）指标；②采用β-catenin基因沉默和PPARγ慢病毒激活方法，以TGF-β1诱导的A549和MRC-5细胞为对象，应用免疫荧光、免疫蛋白印记等技术，观察上皮间质标志物（E-cadherin、Fn1、α-SMA等）、信号通路（Smad3、Wnt1、β-catenin等）指标变化。围绕TGF-β1/wnt/β-catenin与PPARγ通路，阐释金水缓纤方治疗肺纤维的机制，为临床应用提供依据。

本项目确立了肺纤维化大鼠模型制备方法，采用系统药理学阐明金水缓纤方潜在靶点与机制，评价不同时间点金水缓纤方的疗效与远后效应；从TGF-β1/ Wnt/ β-catenin与PPARγ通路、IKK/IκB/NF-κB通路、Nrf2/NOX4通路角度，探讨了金水缓纤方抑制上皮间质转化、炎症反应和氧化应激治疗肺纤维化机制。取得了以下成效：①确定了气管内滴注博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型的方法：以博来霉素（BLM）作为诱导剂，采用气管内滴注和雾化两种方式制备肺纤维化大鼠模型，发现气管内滴注方法病理变化更明显，且稳定持久，更适合药物机制及远后效应研究。②阐明了金水缓纤方有效成分和潜在靶点：系统药理学发现金水缓纤方136个活性成分，作用于265个潜在靶点，富集于MAPK、VEGF、Toll样受体等通路。③探讨了金水缓纤方调控IKK/IκB/NF-κB通路抑制炎症反应治疗肺纤维化机制：金水缓纤方可改善大鼠肺功能和肺病理、降低羟脯氨酸含量，且具有较好的远后效应，在早期即可抑制炎症反应，且在停药4周时仍有效，其作用可能与抑制NF-κB通路阻抑炎症反应有关。④阐释了金水缓纤方调控TGF-β1/β-catenin通路抑制上皮间质转化（EMT）治疗肺纤维化机制：金水缓纤方可降低肺纤维化大鼠肺组织EMT（α-SMA、E-Cad）及TGF-β1/β-catenin通路相关指标， TGF-β1诱导的A549细胞进行β-catenin基因沉默后EMT程度明显减轻，金水缓纤方作用与其相当。⑤探讨了金水缓纤方调控TGF-β1/Smad通路抑制胶原沉积治疗肺纤维化机制：金水缓纤方可显著降低肺组织Col Ⅰ、Col Ⅲ表达，降低p-Smad2、TGF-β1表达，促进PPARγ表达，表明其可通过活化PPARγ调控TGF-β1/Smad通路抑制纤维化。⑥探讨了金水缓纤方调控Nrf2/NOX4通路抑制氧化应激治疗肺纤维化机制：金水缓纤方可下调肺纤维化大鼠氧化产物，提高Nrf2活性，2.5ng/ml TGF-β1可成功诱导MRC-5向肌成纤维细胞转化，应用Nrf2 siRNA阻断后金水缓纤方含药血清对α-SMA、FN1 mRNA的表达没有明显差异，表明金水缓纤方可通过调控Nrf2通路抑制氧化应激进而抑制纤维化。通过研究，从不同角度探讨金水缓纤方作用机制，为临床应用及进一步研究提供依据。