高糖环境下AGEs对大鼠成骨细胞Caspase-3凋亡通路的调控及颌骨缺损修复的影响

Studies have shown that high glucose environment can inhibit the healing of bone defect through various ways, including reduced osteoblastic activity and increased apoptosis of osteoblasts. Our preliminary study demonstrated that high glucose could activate Caspase-3 apoptotic pathway in many kinds of cells and AGEs involved in this process, but the mechanism remains unclear. So we put forward a hypothesis that the increase of AGEs in high glucose environment can induce apoptosis of osteoblasts through Caspase-3 pathway, thereby affecting the healing of jaw defects. To verify this hypothesis, first we will culture rat osteoblasts in vitro and establish maxilla defect models in both diabetic and normal rats. Then we will explore the effects of AGEs on apoptosis of osteoblasts and its mechanism in high glucose environment from the overall level of molecules, cells, tissues and animal by multiple means, such as real-time PCR, Western blot, plasmid transfection, RNA interference, nanomicrocapsule delayed release system, et al. Further in vivo study we will investigate whether the nanospheres of local delivery of AGEs or its inhibitor affect the apoptosis of osteoblasts and the repair of jaw defects in rats. The results of this study will reveal the molecular mechanism of AGEs on apoptosis of osteoblasts induced by high glucose, become the basis of in-depth exploration of osteoblastic activity recovery and also provide a theoretical basis for the repair of bone defect in patients with hyperglycemia.

有研究表明高糖环境可通过多种途径影响骨缺损的愈合，其中成骨细胞活性降低，凋亡增加起重要作用。我们前期研究表明高糖可激活多种细胞内的Caspase-3通路，引发凋亡，AGEs参与其中，但机制不明。因此我们提出假设：高糖环境下AGEs增加，并可通过Caspase-3通路引发成骨细胞凋亡，进而影响颌骨缺损愈合。为验证该假设，我们将通过体外培养大鼠成骨细胞并建立糖尿病大鼠颌骨缺损模型，采用实时PCR、Western blot、质粒转染、RNA干扰、纳米微球缓释等手段，从分子、细胞、组织以及动物整体水平，多方面探讨AGEs在高糖诱发成骨细胞凋亡中的作用及具体机制，并进一步体内探讨纳米微球局部缓释AGEs或其抑制剂对大鼠成骨细胞凋亡及颌骨缺损修复的影响。本课题的结果将揭示高糖环境下AGEs对成骨细胞凋亡调控的分子机制，并成为深入探索高糖下如何恢复成骨细胞活性的基础，为高糖患者骨缺损修复提供理论依据。

高糖可以通过多种方式影响骨缺损愈合,很多途径都与晚期糖基化终末产物AGEs相关,然而,就促进新骨形成,提高骨缺损愈合效果而言,成骨细胞的功能及活性起着至关重要的作用,因此研究高糖状态下AGEs对成骨细胞凋亡的影响及机制,在治疗高糖患者骨缺损方面有重要的临床意义。 本实验首先体外培养大鼠成骨细胞，并进行RAGE、RAGE-shRNA 和对照基因(NS)转染，采用生理糖浓度(5.5mM)和高糖浓度(35mM)刺激正常大鼠成骨细胞，明确高糖环境、Caspase-3与成骨细胞凋亡之间的关系及AGEs的调控作用。结果发现高糖培养或加入AGEs可以抑制大鼠成骨细胞细胞增殖，促进细胞凋亡，加入AGEs抑制剂(sRAGE)对这一现象有一定程度的抑制。转染RAGE基因的成骨细胞，对高糖或AGEs刺激的反应更为敏感，细胞增殖活性及成骨活性受到的抑制更为显著，细胞ALP活性，骨钙素、I型胶原活性及含量低于未转染的成骨细胞，同时活化的Caspase-3及PARP裂解产生85KD的凋亡标志性产物都有升高。加入AGEs抑制剂(sRAGE)对这一现象有一定程度的抑制，但同样不能完全阻断。转染RAGE-shRNA基因的成骨细胞基本与之相反。其次通过蛋白芯片检测高糖作用后，凋亡相关蛋白的表达变化情况，结果发现表达上调的蛋白主要有Caspase-3,Caspase-8,bad,Fas,Fas Ligand,BID等，表达下降的主要有bcl-2,P53等。最后构建正常大鼠及糖尿病大鼠的颌骨缺损模型，采用纳米微球缓释系统，分别包裹AGEs或sRAGE，在进行颌骨缺损自体骨修复的同时植入修复区，于不同时间点处死大鼠，制作修复区硬组织切片，多种方法体内观察高糖因素对修复区新骨形成的影响以及Caspase-3及其酶原procaspase-3在此过程中的含量变化情况，从体内角度明确局部缓释AGEs或sRAGE对颌骨缺损后自体骨修复的影响。结果表明高糖状态下成骨速度缓慢，ALP含量及骨钙素含量有所下降，RAGE及Caspase-3蛋白含量上升，但procaspase-3含量无显著变化。局部缓释AGEs可产生类似于高糖状态下骨缺损修复的效果，而局部缓释sRAGE在一定程度上可缓解高糖状态对骨缺损修复的影响。