鸽子隐花色素蛋白感应磁场的化学机制研究

There are many different species have been found to use the Earth’s magnetic field for their navigation and orientation. The photochemical reaction of cryptochrome, a kind of flavoprotein existed in almost all organisms, has been suggested to be the primary process for magnetoreception. Previously, we observed the magnetic field effects (MFEs) of cryptochrome 1 from homing pigeons (Columba livia, clCry1) under applied magnetic field (0~350μT) as weak as Earth’s magnetic field (~50μT) by time-resolved fluorescence spectra, providing a new proof of the cryptochrome-based model of avian magnetoreception in vitro. But actually, the magnetoreception mechanism is still far from well understood. Here, we plan to study the MFEs of photoreaction of clCry1 to survey the chemical magnetoreception mechanism of Crys. Firstly, the MFEs of clCry1 under different environments, including magnetic field strength, light irradiation condition, solvent and oxygen content, are generalized by time-resolved fluorescence spectra to deduce the characters of magnetic sensitivity of clCry1 and the typical environment conditions. Then EPR and ENDOR technology are used to study the radical pairs formed in clCry1 photoreaction under different typical environment conditions. Accordingly, we can find out the intrinsic relationship between MFEs and characters of radical pairs in clCry1. At the same time, steady-state absorption and steady-state fluorescence spectra are used to study the redox of FAD in ground state protein. These researches should be carried out both in purified proteins and in cell expressed with clCry1. Finally, the chemical magnetoreception mechanisms of clCry1 in vivo and in vitro can be established and the correlation is discussed. These works have important significance for comprehending the magnetic navigation in animals, designing bionic magnetic sensitive moleculars and developing functional device.

许多动物具有地磁导航功能。研究表明，基于隐花色素蛋白（Cry）的光化学反应可能是其感应磁场的原初过程。课题组前期利用瞬态荧光光谱表征出鸽子clCry1对微弱磁场的响应，为基于Cry的化学磁罗盘机制提供了有力证据。但国内外对其作用机理了解仍非常有限。本项目计划利用光谱技术对生物磁导航的原初过程开展系统研究。首先表征不同环境（磁场、光照、溶剂、氧含量）下野生型和突变型clCry1的磁效应，揭示其磁响应规律并筛选典型环境条件；然后利用电子顺磁共振及电子−核双共振技术，考察各典型环境下蛋白光反应的自由基对中间态，找出蛋白磁效应与自由基对的内在联系；再利用稳态光谱表征基态蛋白上FAD的氧还态，确定蛋白光反应的始态；最后，结合转染蛋白的细胞裂解液及纯化蛋白的上述实验结果，推导出蛋白体内和体外感应磁场的化学机制及其相关性。研究成果对动物磁导航行为的理解、仿生磁敏分子的设计及仿生传感器的研制具有重要意义。

许多动物具有地磁导航功能。研究表明，基于隐花色素蛋白（Cry）的光化学反应可能是其感应磁场的原初过程。课题组前期利用瞬态荧光光谱表征出鸽子CCry1对微弱磁场的响应，为基于Cry的化学磁罗盘机制提供了有力证据。但国内外对其作用机理了解仍非常有限。本项目计划利用光谱技术对生物磁导航的原初过程开展系统研究。首先，我们对蛋白的表达和纯化技术开展了系统研究，实现了隐花色素蛋白在真核异源、原核异源以及无细胞中的表达，解决了蛋白的大量、快速、高效且低成本的获取难题。得到了ClCry1/4两种纯化蛋白，并利用瞬态荧光光谱验证了FAD修复ClCry1纯化蛋白的磁敏特性。将克隆的Cry1/2/4基因进行序列比对和分类研究，再结合蛋白上FAD含量的测定，提出ClCry4是光受体，ClCry1/2属于type 2 Cry，是转录抑制因子。后续的蛋白组织分布、节律表达、亚细胞定位等研究进一步证明上述推论。为此，我们提出ClCry4作为鸽子磁受体的观点。随后我们系统考察了ClCry4蛋白的光稳定性和光化学反应，确定了蛋白光反应的始态、中间态，并通过突变体光致还原反应明确基于三个色氨酸的电子传递链对蛋白光受体功能的重要性。基于以上工作，推导出蛋白体内/体外感应磁场的化学机制及其相关性。同时，我们还设计并合成了由黄素与色氨酸通过多个氨基酸共价连接的仿生多肽磁敏分子，进一步证明蛋白感应磁场的化学机制。上述成果均为原创，所得结论不仅能帮助我们更深入地理解动物的磁导航行为，而且对于Cry 蛋白光活化机制的深入了解、仿生磁敏分子的设计、仿生磁传感器的研制以及电子转移理论和自由基对机理的完善都具有重要意义。因为隐花色素蛋白是研究化学反应弱磁效应、长寿命光致电荷分离态的一个优秀模型分子，所以研究工作还将为研究化学反应磁效应、量子纠缠、光合作用提供科学基础，为太阳能电池和新一代光电功能材料及器件的研制提供新思路。