花生非特异性脂质转运蛋白基因（nsLTP）的耐盐机理研究

Nonspecific lipid transfer proteins (nsTLP) is a group of small, soluble proteins, which play an important role in resisting biotic and abiotic stresses in plant. In our previous experiment, an hydroxyproline (HYP)-tolerant mutant with enhanced salt tolerance was generated from in vitro mutagenesis combined with HYP-directed screening. Subsequently, this mutant was used to screen salinity related genes by RNA sequencing technology before and after salt treatment and one nsLTP gene was identified, whose transcription levels were differentially regulated between the control and the HYP-tolerant mutant. In our current study, the corresponding overexpressing constructs of the nsLTP gene will be constructed to transform to peanut to analyze the response of transgenic plants to salt stress and the relevant physiological and biochemical indexes will be measured. Subsequently, the subcellular localization of products will be carried out. Its promoter will be cloned, and a serious of constructs including the complete promoter sequence and serial deletions in the promoter region will be constructed and transformed to analyze salt stress responsive elements. Those researchs will be used to clarify systematically the mechanism of molecular regulation concerning salt tolerance about the nsLTP gene in peanut. This project aims to provide new gene and promoter with intellectual property rights for creating new germplasm by gene engineering, and provides guidance to study on molecular mechanism of salt tolerance. So this study has both great theoretical and practical significance.

非特异性脂质转运蛋白（nsLTP）是一类小的碱性分泌型蛋白，它们在植物抵抗逆境胁迫的反应过程中发挥着非常重要的作用。本课题组前期利用化学诱变与羟脯氨酸（HYP）定向筛选相结合获得一个耐盐性显著提高的HYP耐性突变体，之后应用RNA-Seq技术，对盐胁迫前后HYP耐性突变体和野生型材料中的基因进行了表达谱分析，筛选出在这两种材料中差异表达的1个nsLTP基因。本研究拟将这个nsLTP基因在花生进行遗传转化研究，分析转化子对高盐胁迫的反应，并测定与耐盐相关的生理生化指标；对其产物进行亚细胞定位；克隆它们的启动子，构建完整和缺失启动子系列载体，通过遗传转化分析其盐胁迫响应元件，系统地阐明这个nsLTP基因在花生耐盐中的分子调控机制。本项目的开展，旨在为今后通过遗传工程创造耐盐新种质提供具有自主知识产权的新基因和启动子，也为花生耐盐分子机理研究提供指导，因而具有理论和实践双重意义。

非特异性脂质转运蛋白（nsLTP）是一类小分子碱性蛋白，在植物抵御逆境胁迫中发挥着重要作用。然而，我们对于nsLTP基因在花生中的功能还不了解。本研究从花生野生种中筛选出64个nsLTP基因（AdLTPs），这些基因分为六个亚家族。qRT-PCR结果表明用盐、PEG、低温和ABA处理后，所测试的所有AdLTP基因至少受其中一种处理的诱导表达。我们还发现花生根部受线虫侵染后，3个AdLTP基因的表达量发生明显变化。. 本研究利用花生耐盐突变体和诱变亲本，筛选到2个在盐胁迫处理后差异表达的nsLTP基因（命名为nsLTP1和nsLTPd）。分别构建了pET22b-nsLTP1和pET22b-nsLTPd重组表达载体。对照菌株（pET22b）在含有5.5%NaCl、100 mM NaHCO3和15%PEG的LB液体培养基中均受到明显抑制，而携带nsLTP1和nsLTPd的重组菌在上述培养基中能够生长，表明这2个基因均可以增强重组菌的抗逆能力。. 为了研究nsLTP1和nsLTPd基因在花生中的作用，分别在花生中过表达这2个基因，转基因植株的SOD、POD和CAT酶活性均显著增强，这2个基因均能提高花生植株对盐胁迫的耐受性，同时还可提高转基因花生种子的含油量。进一步研究发现，在花生中过表达nsLTP1基因后，转基因花生种子的下胚轴对ACC处理不敏感，其参与了乙烯的信号转导。分别构建了nsLTP1和nsLTPd基因与GFP基因的融合表达载体，发现这2个基因的表达产物都定位在细胞膜上。. 克隆了这2个基因的全长及系列缺失启动子片段，并分别替换pCAMBIA1301的35S启动子。盐胁迫处理前后进行GUS染色及酶活性测定，结果证实nsLTP1启动子是盐诱导型启动子，ABRE、HSE、LTR、DRE/CRT和MYB这5个元件中的多个元件与该启动子响应盐胁迫有关，P0到P1区域对其活性影响最大。盐胁迫处理前后进GUS染色及酶活性测定，结果证实nsLTPd启动子也是盐诱导型启动子，ABRE、LTR、MYB、MYC、ERE、TC-rich repeats这6个元件中的多个元件与该启动子响应盐胁迫有关，P2到P3区域对其活性影响最大。. 本项目初步阐明了2个nsLTP基因在花生中的耐盐机制，确定了盐胁迫相关的重要顺式调控元件，因而具有重要的理论价值。