磁导航系统调控经修饰后大鼠骨髓来源内皮祖细胞促进糖尿病血管损伤后内皮化研究

Endothelial progenitor cells (EPCs) play an important role in promoting vascular endothelialization. According to our previous report, but the biological functions of EPCs in peripheral blood of diabetic patients is significantly reduced compared with the general population. EPCs mobilization regulated in vivo can improve vascular endothelialization, but this regulating way has some drawbacks, including fewer available cells, low cells use efficiency, poor targeted control performance and no real-time monitoring. Through in vitro system (magnetic navigation system), exogenous EPCs are directly regulated to migrate to injured vessel to accelerate vascular endothelialization, which is a new way worth exploring to improve the efficiency of EPCs recruitment. In addition, compared with the general population, the expression of miR-126, which plays a significant role in the regulation of endothelialization, is significantly decreased in diabetic patients. Therefore on the basis of previous research, we hypothesize that bone marrow-derived EPCs of normal rat can improve the expression of miR - 126 by transfection of miR - 126 mimic, and after that they will phagocytose Fe3O4 nanoparticles to be magnetized. Subsequently, Fe3O4 phagocytosed and miR-126 high expressed EPCs will be controlled by magnetic navigation system to promote vascular repair and accelerates vascular reendothelialization after balloon injury in diabetic rats by enhancing endothelial function to suppress and prevent excessive hyperplasia of endometrium.

内皮祖细胞（EPCs）在促进血管内皮修复过程中具有重要作用，申请人前期研究表明糖尿病情况下EPCs生物功能较正常情况存在明显减退。目前通过体内机制调控EPCs动员可以改善损伤血管内皮化，但体内调节方式存在可用细胞数量少，细胞使用效率低，靶向调控性能差，和不能实时监控等缺陷，而通过体外系统（磁导航系统）直接调控外源性EPCs向血管损伤部位迁移参与血管内皮化，以提高EPCs招募效率，是一值得探索的新方式。此外，糖尿病患者较正常人群相比，其体内对调节内皮化具有重要作用的miR-126表达明显降低。我们计划在前期研究基础上，拟通过正常大鼠骨髓来源的EPCs转染miR-126 mimic，提高其miR-126表达，并使miR-126高表达EPCs吞噬Fe3O4纳米颗粒获得磁性后，在磁导航系统引导下使其定向迁移至糖尿病大鼠球囊损伤动脉血管处促进血管内皮细胞爬覆（促进内皮化），以抑制和预防内膜过度增生。

内皮祖细胞（EPCs）有助于通过促进内皮化来帮助损伤血管的修复，而在糖尿病环境下存在血管内皮化延迟现象，其与EPCs低表达miR-126存在相关性，因此在糖尿病患者体内如何将足够数量的具有活性的EPCs招募和动员至病变部位仍面临一系列难题，探索一种新型给药方式以提高EPCs招募效率因此具有重要的意义。本课研究者首先从大鼠骨髓中分离EPCs，并通过慢病毒转染构建过表达miR-126的EPCs，观察EPCs的迁移、黏附和增殖能力变化情况，并建立糖尿病大鼠颈动脉损伤模型，评估磁导航系统调控EPCs促进内皮化能力。细胞免疫染色显示成功分离并培养大鼠骨髓来源的EPCs，转染miR-126后EPCs增殖能力（0.20±0.01 vs 0.13±0.02,P=0.012）、黏附能力（17.8±1.8/×200高倍视野 vs 14.9±1.4/×200高倍视野,P=0.021）和迁移能力（17±1.8/×200高倍视野 vs 13.5±2.3/×200高倍视野,P=0.001）较正常EPCs均有所增加；此外，miR-126-EPCs在糖尿病大鼠颈动脉内皮损伤后的可加速再内皮化，显著高于常规EPC（第7天为50.3±4.7% vs 33.6±5.8%，P<0.001；第14天为84.9±5.1% vs 79.6±5.7%，P=0.003）。通过苏木精-伊红染色检测miR-126-EPCs对新生内膜增厚的影响，miR-126-EPCs内膜面积/中膜面积比在第7天（0.278±0.071）和第14天（0.683±0.122）显著降低，而用常规EPC的在第7天为0.396±0.107，在第14天为0.975±0.167（P<0.05）。在磁调控系统作用下，结果显示EPCs吞噬75ug/ml浓度的Fe3O4纳米颗粒较为合适，细胞活性及移动效率均较高，移动速度可达到0.5±0.1cm/s。结果显示磁调控系统可有效调控EPCs至病变损伤处，较未调控相比，损伤部位的EPCs细胞数明显多于未调控的（13.3±5.0 vs 1.3±0.5,P=0.004）。综上所述，miR-126转染EPCs可以细胞过表达miR-126，EPCs通过体外磁导航系统调控可促进糖尿病大鼠球囊损伤模型的血管内皮化修复，初步论证了其在血管内皮化方面应用的有效性，为通过发挥干细胞治疗效果降低介入术后血管再狭窄提供新的解决思路。