炎症诱导的ARMET转录激活及其对NF-κB信号通路的调节机制

ARMET是一个分泌型蛋白，内质网应激上调其表达，且对神经元损伤有保护作用，但它与炎症的关系未见报道。我们的研究发现：关节局部炎症可上调其表达，它的诱导表达对炎性滑膜细胞的过度增殖有抑制作用，且在炎症刺激下可从胞浆转运至胞核。对此我们的问题是：（1）炎症刺激如何激活ARMET转录？（2）炎症刺激的ARMET核转运是否与调节NF-κB信号通路有关？为此我们拟克隆ARMET 5'端非翻译区并对其上游转录因子结合位点逐一突变，通过荧光素酶报告基因技术、ChIP、EMSA等研究在炎症诱导下转录因子（AP-1、SP-1、XBP-1等）对ARMET的转录调控以及ARMET对NF-κB转录活性的影响；通过Co-IP、Pull-down 及免疫荧光双标等研究ARMET和p65之间的相互作用并鉴定其功能区；通过siRNA技术了解ARMET对NF-κB的调节是否依赖于IκBs和IKK复合体等。

ARMET，又名中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子（MANF），是一个内质网（ER）应激可诱导型的分泌蛋白，除了其对神经元损伤有保护作用外，我们的研究阐明了以下科学问题：1、炎症刺激如何激活MANF转录？2、炎症刺激下MANF的核转运是否与抑制NF-κB信号通路有关？3、MANF是否可以抑制炎性关节滑膜细胞的过度增殖？本项目具体的研究结果如下：（1）我们采用qPCR方法检测了类风湿关节炎（63例）、系统性红斑狼疮（65例）和强制性脊柱炎（26例）病人外周血白细胞（PBWC）中MANF及非折叠蛋白反应（UPR）基因的mRNA水平。结果发现，UPR三条信号通路基因在上述3种疾病中的表达差别很大，而MANF在上述3种疾病中的表达均被上调。在甲基化的牛血清白蛋白诱导的兔关节炎及弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎模型中，PBWC和滑膜组织中的MANF转录水平均升高，滑膜上的BIP和CHOP表达也上调，该结果提示炎症可诱导ER应激及MANF表达。（2）我们克隆了MANF 5' 端非翻译区，并对其上游转录因子结合位点逐一突变，通过荧光素酶报告基因技术、ChIP等技术研究发现，在炎症诱导下，转录因子XBP1、AP-1和SP-1能分别与MANF 5' 端非翻译区分布的ER应激反应元件（ERSE）结合并激活MANF的转录。（3）我们的研究还发现，炎症因素（如LPS、TNF刺激）或ER应激诱导剂tunicamycin（TM）可以诱导MANF转运至细胞核，并与p65共定位；通过Co-IP、Pull-down 及免疫荧光双标等研究证明，MANF的C端可以与p65的DNA结合域相互作用，这种相互作用出现在细胞核，且仅在炎症或ER应激下发生；通过荧光素酶报告基因、ChIP、EMSA等技术证明转运至细胞核中的MANF可以通过与p65相互作用抑制NF-κB的转录活性；但MANF对细胞内p65和IκB的总体水平无影响。同时MANF可以抑制NF-κB下游基因的激活。（4）采用重组的MANF处理、过表达或敲低内源性的MANF等方法，发现MANF可抑制原代培养的滑膜细胞的增殖及炎性细胞因子的表达与分泌。上述结果提示，炎症或ER应激可以上调MANF的表达，且MANF通过与p65的相互作用抑制NF-κB激活，从而抑制炎症。故炎症时MANF的上调是机体的一种适应性调节。