a-珠蛋白基因启动子甲基化对HbH病表型修饰的作用机理研究

HbH病是a-地中海贫血存活者中最严重的一种，临床表现差异较大，目前产前基因检测只能诊断HbH病而无法判断胎儿出生后的严重程度和预后情况，给产前诊断和早期干预带来了困难。本项目前期实验显示a-地中海贫血患者与正常人外周血在a-珠蛋白基因上存在CpG岛甲基化、mRNA表达量的差异性，推测a-珠蛋白基因的甲基化调控可能参与了HbH病表型的修饰作用。本研究拟针对HbH病基因型相同而表型不同的现象，通过MassARRAY定量检测a-珠蛋白基因启动子CpG岛甲基化水平，采用实时定量RT-PCR检测a-珠蛋白基因mRNA，分析a-珠蛋白基因甲基化与HbH病表型差异的关系及作用机理；同时通过DNA甲基转移酶抑制剂体外培养重症HbH病红系前体细胞，进一步探讨甲基化作用对体外培养红细胞a-珠蛋白基因转录和翻译的调节作用，这不但可能为HbH病的产前诊断提供新的诊断指标，而且对HbH病的早期干预也具有重要意义。

HbH病是a-地中海贫血存活者中最严重的一种，临床表现差异较大，目前产前基因检测只能诊断HbH病而无法判断胎儿出生后的严重程度和预后情况，给产前诊断和早期干预带来了困难。本研究通过甲基化芯片检测轻度地中海贫血和重度地中海贫血血样基因启动子CpG岛甲基化水平，筛选在轻度地中海贫血和重度地中海贫血血样中存在显著变化的基因共209条；其中上调基因共113条，下调基因共96条(ratio≥2.0 or≤0.50)，然后采用Pathway与相关疾病分类，筛选出11条有甲基化变化、且与血液病及遗传病直接相关的基因，包括CBFB、HDAC3、IL12A、PLAT、RTKN、RAD52、PTGS1、LARP2、IGSF4和THRA；同时我们采用了表达谱芯片分别筛选在中重度HbH病血样和轻度HbH病血样中存在显著变化(Cy5/Cy3≥2或Cy5/Cy3≤0.5)的基因，进行分层聚类分析，并使用TREEVIEW软件查看，可见两者差异表达基因共251条(ratio≥2.0或≤0.5)，其中上调基因159条和下调基因92条。根据分层聚类分析将23例重度HbH病和5例轻度HbH病对照血样完全分开，聚类结果显示IGSF4基因启动子区甲基化程度已经成功将重度HbH病和轻度HbH病外周血区分成两部分。经MassARRAY甲基化质谱测序对12个CpG位点进行对比分析，结果显示a-globin基因启动子区的12个CpG位点在重度HbH病相对于轻度HbH病外周血甲基化程度明显增高。然后采用实时定量RT-PCR检测a-globin基因mRNA、IGSF4基因，结果显示与正常脐血和外周血相比，该基因在中重度HbH病中呈低表达，且有显著性差异。其后采用了DNA甲基转移酶抑制剂体外培养重症HbH病红系前体细胞，采用实时定量RT-PCR检测a-珠蛋白基因mRNA，显示抑制剂培养后的细胞较培养前IGSF4基因、a-globin基因表达增高，以上实验结果提示IGSF4基因启动子甲基化、a-globin基因启动子区的12个CpG位点对a-珠蛋白基因的甲基化调控可能参与了HbH病表型的修饰作用。